干燥工藝對(duì)馬蹄大黃產(chǎn)地加工效果的影響

盧 琪，薛淑靜，楊 德，王少華，劉 益，李 露*

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064；2. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434023)

大黃為蓼科植物，是一味常用大宗藥材，歷代本草均有收載，富含蒽醌、蒽酮、萘苷類、酰基糖苷類、茋類及鞣質(zhì)等活性成分，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效，廣泛用于醫(yī)藥中間體提取、中藥飲片生產(chǎn)、中成藥生產(chǎn)和保健品生產(chǎn)，市場(chǎng)領(lǐng)域十分廣闊[1-4]。恩施州所產(chǎn)大黃，其基源為藥用大黃，因加工的大黃藥材產(chǎn)品形如馬蹄，又稱馬蹄大黃，是恩施州的特色道地藥材。馬蹄大黃適宜在海拔1 300 m 左右的地區(qū)生長，生長采收周期為3 年，具有藥效穩(wěn)定、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是恩施州高山鄉(xiāng)鎮(zhèn)實(shí)施產(chǎn)業(yè)扶貧和實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定脫貧的好產(chǎn)業(yè)。

中藥歷來注重來源及產(chǎn)地加工方法，不同種類、不同產(chǎn)地加工方法，其質(zhì)量差異較大[5]。大黃常采用炕干法進(jìn)行干燥，此外還有烘干、晾干、曬干等[6]。研究表明，炕干方法不僅時(shí)間長達(dá)7 d 以上，產(chǎn)品質(zhì)量難以把控、極易造成大黃品質(zhì)下降[7]。大黃主根較粗大，不易干燥，熏干、晾干、曬干過程緩慢，可能造成大黃干燥過程中霉變、走油、色澤和氣味的裂變等，導(dǎo)致大黃干燥效率低、品質(zhì)不均一等[8]。此外，大黃中含有豐富的活性成分，如鞣質(zhì)類、二蒽酮類、游離蒽醌類及結(jié)合蒽醌類，通過提高干燥溫度或減小切片厚度，能定向加工出清熱瀉火型大黃，即最大程度保留結(jié)合型蒽醌[9]。譚鵬等[10]將大黃定制成5 mm 的薄片，45 ℃連續(xù)干燥8 h，能夠保留游離蒽醌總量和番瀉苷A、B 的含量，而另有研究表明大黃在50 ℃條件下干燥不利于番瀉苷A的累積[11]。上述研究尚缺少對(duì)大黃產(chǎn)地加工效率和加工品質(zhì)的統(tǒng)一考察。

為確保馬蹄大黃道地藥材質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)馬蹄大黃的規(guī)范、高效加工，獲得品質(zhì)優(yōu)良、性狀均一的加工產(chǎn)品，探討研究馬蹄大黃產(chǎn)地加工工藝迫在眉睫。本研究在探討干燥效率的基礎(chǔ)上，對(duì)比各干燥條件下馬蹄大黃的成分含量和抗氧化性能，以期建立馬蹄大黃高效、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)地加工工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 馬蹄大黃于2019 年12 月采收于湖北省恩施州利川市，品種鑒定為藥用大黃（Rheum officinaleBaill.），選取三年生的馬蹄大黃為研究對(duì)象。

色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品（決明柯酮、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃甲醚）及分析試劑（Folin-Ciocalteu 試劑、抗壞血酸、2, 2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）、1, 3, 5 - 三（2-吡啶基）-2, 4, 6 - 三嗪（TPTZ）均購于源葉生物科技有限公司。ABTS·+試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)分析純化學(xué)品購于國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀（Multiskan GO），美國Thermo Fisher 公司；熱風(fēng)干燥機(jī)（DHG-9140），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ5200DE），昆山市超聲儀器有限公司；超高效液相色譜儀（Waters Acquity)，美國Waters 公司；液相色譜柱(UPLC BEH C18，100 mm × 2.1 mm, i d.,1.7 μm)，美國Waters 公司；色差儀（CR-400），日本Minolta Camera 公司。

1.2 方法

1.2.1 大黃干燥工藝 新鮮的馬蹄大黃洗凈、晾干。按照市場(chǎng)要求，將馬蹄大黃鮮樣切分至4～5 cm 左右的厚度，進(jìn)行干燥：（1）連續(xù)干燥，50、55、60、65、70、75 和80 ℃，熱風(fēng)干燥；（2）結(jié)合傳統(tǒng)發(fā)汗工藝進(jìn)行馬蹄大黃干燥。大黃干燥過程中發(fā)汗一次，時(shí)長12～24 h[6]，然而發(fā)汗中后期大黃質(zhì)量無進(jìn)一步的減少，影響干燥效率。本研究在結(jié)合干燥效率和傳統(tǒng)干燥模式的前提下，采用間歇式的干燥模式，即干燥4 h 后間歇2 h（模擬發(fā)汗），如此往復(fù)，直至馬蹄大黃含水量少于15%[12]，干燥溫度設(shè)置為：60、65、70、75 和80 ℃。

1.2.2 成分檢測(cè) 參考中國藥典2015 版的要求[12]對(duì)馬蹄大黃蒽醌類成分進(jìn)行提取。大黃干燥后粉碎（過4 號(hào)篩），稱取0.15 g，加入甲醇25 mL，加熱回流1 h，冷卻，補(bǔ)足體積，過濾，得到甲醇提取液。取甲醇提取液5 mL，揮發(fā)去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，冷卻后置于分液漏斗中分液，取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3 次，合并，減壓蒸干，殘?jiān)眉状紡?fù)溶后過濾，得到酸解萃取液。將甲醇提取液和酸解萃取液分別進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MSn 分析。流動(dòng)相（A）蒸餾水/甲酸（0.1%，V/V）；（B）甲醇。洗脫程序：0 min，85%A；5 min，65%A；15 min，45%A；27 min，15%A；29 min，85%A；32 min，85%A；流速0.3 mL·min-1，UV-Vis 采集范圍210～600 nm，檢測(cè)波長為254 nm。質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式，離子源源溫度120 ℃；錐氣流，50 L·h-1； 去溶劑溫度，450 ℃；脫溶劑氣流，800 L·h-1。樣品錐電壓和毛細(xì)管電壓分別為30 V 和2 500 V。

1.2.3 水分干燥速率 用105 ℃干烘箱燥大黃至恒重，檢測(cè)大黃水分含量。大黃水分干燥速率按照不同干燥時(shí)間大黃重量變化程度計(jì)算[13-14]，公式如下：

X0，大黃初始重量；Xt,干燥一定時(shí)間大黃重量；Xe,大黃干燥絕對(duì)重量。

1.2.4 總酚與總黃酮 采用Folin-Ciocalteu 方法計(jì)算大黃中總酚含量，結(jié)果用每克干大黃中沒食子酸當(dāng)量表示（mg·g-1）。采用NaNO2-AlCl3-NaOH 方法計(jì)算大黃中總黃酮含量，結(jié)果用每克干大黃中蘆丁當(dāng)量表示（mg·g-1）。

1.2.5 抗氧化能力分析 DPPH 自由基清除能力[15-16]：

將65 μmol·L-1的DPPH 乙醇溶液280 μL 與20 μL抗壞血酸標(biāo)品或大黃粉的甲醇提取液（如1.2.3 所述）混合，置于96 孔板中，放置30 min，酶標(biāo)儀517 nm 下讀數(shù)。大黃DPPH 自由基清除能力以每克大黃粉中毫摩爾抗壞血酸當(dāng)量表示（mmol·g-1）。FRAP 鐵離子還原能力[15-16]：20 μL 大黃粉的甲醇提取液或抗壞血酸標(biāo)品與280 μL Ferric-TPTZ 試劑混合，放置30 min，酶標(biāo)儀593 nm 下讀數(shù)。FRAP 值表示為每克大黃粉中抗壞血酸當(dāng)量（mmol·g-1）。ABTS·+自由基清除能力[15-16]：按照試劑盒說明書要求制備ABTS·+工作溶液。10 μL 大黃粉的甲醇提取液或水溶性維生素E（Trolox）標(biāo)品與200 μL 的ABTS·+工作液混合，放置6 min，酶標(biāo)儀734 nm 下讀數(shù)。大黃ABTS·+值以每克大黃粉中trolox 當(dāng)量表示（μmol·g-1）。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±SD 值表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選擇Duncan 分析進(jìn)行樣本單因素方差分析，P＜ 0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻干燥過程中水分變化速率

50～80 ℃條件下連續(xù)熱風(fēng)干燥馬蹄大黃，使其水分含量滿足藥典要求，需要48～96 h，干燥過程中馬蹄大黃水分含量變化速率如圖1 所示。高溫干燥雖然能耗大，但能夠促進(jìn)水分散失，提高干燥效率[17]。唐古特大黃，切片（3 cm）后干燥，45～85 ℃條件下需要19～56 h[2]，遠(yuǎn)小于本研究的干燥時(shí)間，可能與不同大黃品種的個(gè)體大小有關(guān)。本研究的馬蹄大黃個(gè)大、飽滿，單個(gè)重約2 000 g，切片的重量約250 g，干燥難度較大。60～80 ℃條件下模擬發(fā)汗處理，間歇干燥馬蹄大黃，干燥時(shí)間需要60～96 h。 間歇干燥過程中馬蹄大黃水分含量變化速率如圖2 所示。相比連續(xù)干燥，相同溫度下間斷干燥耗時(shí)較長，但能充分利用余熱，有利于水分由內(nèi)而外的散出，所以間歇干燥能耗少，節(jié)能環(huán)保。傳統(tǒng)大黃發(fā)汗工藝，即干燥中途發(fā)汗一次，時(shí)長12～24 h[6]，頗為耗時(shí)，不符合馬蹄大黃的高效干燥工藝的要求。本研究采用間歇干燥法的同時(shí)兼顧發(fā)汗工藝，有利于大黃干燥效率的提高。

圖1 不同溫度連續(xù)干燥過程中馬蹄大黃的水分變化速率Figure 1 The changes of moisture rates in horseshoe shaped Rheum officinale Baill. during continuous drying at different temperature

圖2 不同溫度間斷干燥過程中馬蹄大黃的水分變化速率Figure 2 The changes of moisture rates in horseshoe shaped Rheum officinale Baill. during intermittent drying at different temperature

2.2 馬蹄大黃蒽醌類成分推斷及定量分析

馬蹄大黃甲醇提取物、酸解產(chǎn)物及5 種標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖如圖3 所示。按照液相出峰的紫外吸收光譜、出峰順序以及質(zhì)譜離子碎片信息，結(jié)合前人的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)馬蹄大黃提取成分逐一進(jìn)行定性分析[18-20]，結(jié)果如表1 所示。峰10～14 對(duì)應(yīng)5 種標(biāo)準(zhǔn)品，分別是蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃甲醚。峰10 的分子離子峰為m/z 269.1[M-H]-，峰1 的分子離子峰為m/z 431.1[M-H]-，兩者相差162，即峰1 中存在葡萄糖基。蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷在大黃中存在量大，能夠分離制備[18]，推測(cè)峰1 為蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷。根據(jù)質(zhì)譜信息和紫外吸收?qǐng)D譜，峰2 為番瀉苷，峰3 為決明柯酮-8-O-葡萄糖苷[21]。峰6 的分子離子峰m/z 449.1[M-H]-，比峰3（m/z 407.1[M-H]-）多42，推測(cè)峰6 比峰3 多一個(gè)乙?；?，為決明柯酮-8-O-乙?；咸烟擒?。按同樣的推斷方式，結(jié)合液相出峰順序，峰4、5、7、8 和9 分別為大黃酚-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-乙?；咸烟擒?、大黃甲醚-8-O-葡萄糖苷和大黃甲醚-8-O-乙酰基葡萄糖苷[19-20]。 按照藥典要求，大黃經(jīng)甲醇提取后進(jìn)行鹽酸水解，可將化合物中的糖苷鍵打開，使糖基游離出來，形成對(duì)應(yīng)的苷元[15]。 如圖3 所示，經(jīng)酸解后，峰1 蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷消失，其對(duì)應(yīng)的苷元蘆薈大黃素（峰10）明顯增加；峰4、5 和7 消失，三者對(duì)應(yīng)的苷元大黃酚明顯增加（峰13）；峰8 和9 消失，二者對(duì)應(yīng)的苷元大黃素甲醚明顯增加（峰14）。大黃素和大黃酚（峰11 和12）在甲醇提取液中含量微弱，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的糖苷，但在酸解液峰11 和12 均有所增加，推測(cè)大黃素和大黃酚可能以聚合體或多種微量糖苷的形式存在。 酸解可以簡化成分，方便計(jì)算，但操作繁瑣，且不能全面反應(yīng)成分組成，故本研究對(duì)大黃甲醇提取液直接進(jìn)行分析。糖苷化合物采用其對(duì)應(yīng)苷元的標(biāo)品進(jìn)行相對(duì)定量，即峰1 采用蘆薈大黃素標(biāo)曲定量，峰4、5 和7 采用大黃酚標(biāo)曲定量，峰8 和9 采用大黃素甲醚標(biāo)曲定量，其他3 種成分，峰2、3 和6 均采用紫外吸收光譜接近的大黃素標(biāo)曲定量。

馬蹄大黃甲醇提取液中共鑒定得到的14 種成分，其中蒽醌類成分13 種，蒽醌類成分含量占總成分的85.31%～95.65%，各干燥條件下的成分含量如表2 所示。采用70 和80 ℃連續(xù)烘干得到總蒽醌類化學(xué)成分總和最高，而60 ℃間接干燥蒽醌類總含量最低。分析對(duì)比糖苷類成分及其對(duì)應(yīng)的苷元，如蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷與蘆薈大黃素；大黃酚-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-乙?；咸烟擒张c大黃酚；大黃甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黃甲醚-8-O-乙?；咸烟擒张c大黃甲醚，得到如下規(guī)律：（1）連續(xù)干燥和間歇干燥，隨著的溫度苷元類成分（蘆薈大黃素、大黃酚與大黃甲醚）逐漸減少，而與苷元對(duì)應(yīng)的各類糖苷則呈增加趨勢(shì)，說明隨著烘干時(shí)間的延長，糖苷類化合物逐漸水解，形成其對(duì)應(yīng)的苷元[6]；（2）大黃酚及其葡萄糖苷是馬蹄大黃中主要的蒽醌類化合物；（3）間歇干燥，即模擬發(fā)汗干燥，相比同溫度的連續(xù)干燥，延長了干燥時(shí)間，更加劇了糖苷類蒽醌物質(zhì)的水解，且總蒽醌類成分的含量并未因模擬發(fā)汗處理得到改善。

圖3 馬蹄大黃甲醇提取物、酸解產(chǎn)物及5 種標(biāo)品的液相色譜圖Figure 3 Liquid chromatograms of methanol extracts, acidolysis products and five commercial standards of horseshoe shaped Rheum officinale Baill.

表1 UPLC-Q-TOF-ESI-MSn 推斷馬蹄大黃提取成分Table 1 The identification of chemical compounds extracted form horseshoe shaped Rheum officinale Baill. by UPLC-Q-TOF-ESI-MSn

表2 馬蹄大黃甲醇提取蒽醌類化學(xué)成分的定量分析Table 2 Quantitative analysis of the anthraquinones of methanol extract of horseshoe shaped Rheum officinale Baill. μg·g-1

2.3 馬蹄大黃總酚、總黃酮及抗氧化能力分析

各干燥條件下馬蹄大黃甲醇提取液的總酚、總黃酮含量及抗氧化能力（DPPH、FRAP、ABTS）對(duì)比如表3 所示。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)總酚和總黃酮之間具有良好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)，r2= 0.787），而總酚、總黃酮與總蒽醌類成分的相關(guān)性較差。本研究中馬蹄大黃甲醇提取物中除蒽醌類物質(zhì)外，馬蹄大黃提取液中存在其他的酚類或黃酮類成分。前人研究表明，大黃藥材中存在沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇葡萄糖苷等其他酚類化合物，其中兒茶素是主要成分[22-23]。相同溫度下，連續(xù)干燥馬蹄大黃的各抗氧化能力要優(yōu)于間歇干燥，可能與糖苷鍵的水解有關(guān)，糖苷鍵對(duì)酚類成分抗氧化性能尤為重要[24]。對(duì)比抗氧化能力，80 ℃連續(xù)干燥的馬蹄大黃具有最強(qiáng)的DPPH、ABTS 自由基清除能力，50 ℃連續(xù)干燥的馬蹄大黃具有最優(yōu)的鐵離子還原能力，但整組實(shí)驗(yàn)的鐵離子清除能力無顯著差異。

表3 不同干燥條件下馬蹄大黃總酚、總黃酮及抗氧化能力對(duì)比Table 3 Comparison of total phenolic content, total flavonoid content and antioxidant capacity of horseshoe shaped Rheum officinale Baill. under different drying conditions

3 討論與結(jié)論

恩施利川的馬蹄大黃飽滿、粗壯，難以干燥，干燥速率是制約其產(chǎn)地加工的重要因素。本研究按市場(chǎng)對(duì)馬蹄大黃原料的要求，將其切成厚片（4～5 cm），進(jìn)行連續(xù)熱風(fēng)干燥和間歇熱風(fēng)干燥（模擬發(fā)汗工藝）。研究結(jié)果表明，馬蹄大黃中有14 種活性成分，包含11 種蒽醌類成分，馬蹄大黃中的蒽醌類成分多以糖苷的形式存在，與前人的研究基本一致[25]。提高干燥溫度或減小切片厚度，能減少大黃加熱時(shí)間，最大程度保留結(jié)合型蒽醌，從而定向加工出清熱瀉火型大黃[9]。本研究發(fā)現(xiàn)干燥過程中蒽醌類成分的糖苷鍵逐漸水解，形成游離的苷元，干燥速率越慢，糖苷水解越嚴(yán)重。糖苷鍵對(duì)酚類成分抗氧化性能尤為重要，這一水解過程可能影響后續(xù)大黃提取成分的抗氧化能力。

各干燥條件下，80 ℃連續(xù)干燥，馬蹄大黃蒽醌類成分總量最多，60 ℃間歇干燥蒽醌類成分總量最少。相同溫度下，間歇干燥充分利用余熱，干燥馬蹄大黃能耗小于連續(xù)干燥，但連續(xù)干燥的蒽醌成分含量、抗氧化性能均要優(yōu)于間歇干燥。80 ℃連續(xù)干燥馬蹄大黃，干燥速率快，總蒽醌、總酚、總黃酮含量高，抗氧化能力強(qiáng)，最適于馬蹄大黃的干燥。本文僅針對(duì)2019 年11 月采收的三年生大黃進(jìn)行研究，不同成熟期和采收時(shí)間的馬蹄大黃的干燥工藝需要進(jìn)一步研究、驗(yàn)證。