60Co-γ射線對(duì)日本囊對(duì)蝦誘變子代遺傳多樣性和生長(zhǎng)的影響

劉 波，鄭雅友，李正良

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013)

日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)是我國(guó)較重要的養(yǎng)殖蝦類之一，養(yǎng)殖過程中種質(zhì)不斷衰退，病害頻發(fā)，其種質(zhì)的優(yōu)劣已經(jīng)成為影響產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。研究表明，水生生物對(duì)病害的易感和緩慢的生長(zhǎng)與其群體較低的遺傳多樣性水平密切關(guān)系[2]。60Co-γ射線誘變?cè)谟N實(shí)踐和遺傳學(xué)研究中有著廣泛應(yīng)用，已在農(nóng)作物育種中被大量使用，并取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[3]。但是，相關(guān)技術(shù)手段在水生生物遺傳選育的領(lǐng)域使用較少：劉曉等利用60Co-γ射線對(duì)成體長(zhǎng)牡蠣進(jìn)行了照射，研究了射線對(duì)長(zhǎng)牡蠣生長(zhǎng)的影響規(guī)律[4]；筆者記錄了60Co-γ射線對(duì)日本囊對(duì)蝦誘變不同實(shí)驗(yàn)組的孵化率、存活率[5]，總體來說，現(xiàn)階段可查閱的相關(guān)文獻(xiàn)資料較少。本文主要探討了在不同誘變劑量下60Co-γ射線對(duì)日本囊對(duì)蝦誘變子代遺傳和生長(zhǎng)的影響，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)從分子水平對(duì)各組誘變子代的遺傳差異進(jìn)行分析，旨在為增加日本囊對(duì)蝦子代群體的遺傳多樣性水平提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 誘變子代的來源

日本囊對(duì)蝦的親本為性腺發(fā)育良好、處于繁殖期的個(gè)體，體長(zhǎng)為23～27 cm，共75尾。誘變子代為親本經(jīng)過60Co-γ射線照射后孵化的苗種，在土池中培育90 d后隨機(jī)采集各實(shí)驗(yàn)組樣本(各30尾)進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)量，并采集肌肉樣本，制備高質(zhì)量大片段基因組DNA樣本(共40份)備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材

鈷60治療機(jī)：國(guó)產(chǎn)FCC8000型；PCR儀：Biometra公司的T3型；紫外分光光度計(jì)：Varian公司的Cary 50型；高壓電泳儀：BIO-RAD公司的PowerPac 3000型；垂直電泳槽：BIO-RAD公司的Sequi-Gen GT型；超凈工作臺(tái)：凈化設(shè)備工程有限公司的SW-CJ-1F型；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司的5810R型；生物分析儀：Agilent公司的2100型。

1.1.3 試劑

Taq聚合酶(Fermentas公司)；GeneRuler 50 bp DNA Ladder(Fermentas公司)；組織/細(xì)胞DNA(小量)抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)；AFLP Analysis SystemⅠ試劑盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 親蝦的處理及苗種培育

日本囊對(duì)蝦剪除眼柄后暫養(yǎng)于廈門市水產(chǎn)研究所前埔實(shí)驗(yàn)場(chǎng)24 m2水泥池內(nèi)，連同對(duì)照組在內(nèi)共設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組15尾。親蝦性腺成熟后在廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行60Co-γ射線照射，誘變劑量為50、100、1 000、1 500 cGy，劑量率為3.4 cGy/sec。

收集照射后當(dāng)天產(chǎn)卵親蝦的受精卵，放置于半噸桶，按照常規(guī)的對(duì)蝦苗種繁育技術(shù)規(guī)范培育，仔蝦達(dá)到P20階段時(shí)，將上述苗種以15尾/m2(根據(jù)網(wǎng)箱面積計(jì)算)的養(yǎng)殖密度放置于室外土池中，使用2.5 m×2.5 m×2.0 m的塑膠網(wǎng)箱(各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行)在同一水體中培育3個(gè)月(使用相同品牌、相同餌料量進(jìn)行培育)，每天投餌2次，各實(shí)驗(yàn)組日投餌率均相同。

1.2.2 誘變子代基因組DNA的制備

各實(shí)驗(yàn)組共隨機(jī)采集40尾誘變子代(每組8尾)，經(jīng)過蒸餾水洗滌后，剪下肌肉組織約25 mg，在液氮中研磨成白色粉末。使用上海華舜生物工程有限公司的組織/細(xì)胞DNA(小量)抽提試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。提取出來的DNA通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，將各組DNA用超純水稀釋為10 μg/mL的模板DNA；瓊脂糖凝膠電泳和生物分析儀2100檢測(cè)DNA完整性。

1.2.3 AFLP反應(yīng)

雙酶切：取基因組DNA 100 ng，加入EcoR1和Mse1兩種內(nèi)切酶各1 U和相應(yīng)的緩沖液，在37℃條件下反應(yīng)2 h。酶切后在70℃下作用15 min使酶失活。

連接：在20 μL反應(yīng)體系中，含有雙酶切后的模板DNA 10 μL、T4連接酶1 U，連接緩沖液10 μL，在20℃條件下反應(yīng)2 h。連接反應(yīng)產(chǎn)物取5 μL用TE稀釋10倍備用，其余部分-20℃保存。

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃ 2 min；(94℃ 30 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s)×20 cycles；預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物取3 μL用TE稀釋50倍備用，其余部分-20℃保存。

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃ 2 min；(94℃ 45 s，65～56℃ 45 s，72℃ 90 s)×13個(gè)循環(huán)；(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s)×23個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。

EcoR I 接頭(Adapter)：5’-CTCGTAGACTGCGTACC，CATCTGACGCATGGTTAA-’5。

Mse I 接頭(Adapter)：5’-GACGTGAGTCCTGAG，TACTCAGGACTCAT-’5。

預(yù)擴(kuò)增引物(Pre-amplification primers)序列：E05’-GACTGCGTACCAATTC-3’M05’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’

選擇性擴(kuò)增引物(Selective-amplification primers)序列：

E-ACA/M-CAG E-ACT/M-CAT

E-AGC/M-CTG E-AGA/M-CTT

E-AGA/M-CAG E-ACC/M-CAC

E-ACC/M-CTT E-AGG/M-CAC

E-ACA/M-CAA E-AAG/M-CAT

制膠：將玻璃板清洗干凈，用75%酒精擦洗一遍。在較長(zhǎng)的玻璃板涂一層硅烷黏合劑。晾干后將兩塊玻璃板夾好，封住底邊。配制6%變性聚丙稀酰胺凝膠，灌膠。水平放置1 h等待凝膠凝固。

電泳：AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳前加入4μL上樣緩沖液，在PCR儀上95℃變性5 min，冰浴10 min。膠凝固后先進(jìn)行預(yù)電泳，電泳時(shí)電壓2 000 V，功率70 W，電流55 mA。當(dāng)凝膠溫度上升至50℃時(shí)，取4 μL變性好的樣品加入電泳槽中電泳。電泳功率70 W，電壓2 000 V 左右，電流55 mA，電泳大約1.5 h，電泳緩沖液為1×TBE。

染色：將凝膠冷卻5 min，然后浸泡在10%的乙酸中進(jìn)行固定，置于水平搖床上振搖約30 min；取出凝膠，用預(yù)冷的蒸餾水沖洗2次，放入銀染液中，再置于搖床上振搖約30 min；取出凝膠，用預(yù)冷的蒸餾水沖洗2次，浸入顯色液中至顯出清晰的條帶，放入10%乙酸溶液中中止顯色，觀察并拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)

當(dāng)某一擴(kuò)增片段出現(xiàn)時(shí)記為1，不出現(xiàn)時(shí)記為0，將AFLP指紋圖譜中分子量從50 bp到2 000 bp之間的條帶轉(zhuǎn)換成數(shù)字矩陣，根據(jù)Nei M等[6]和Lynch M[7]的計(jì)算公式，計(jì)算各個(gè)實(shí)驗(yàn)組遷移率不同的擴(kuò)增片段數(shù)目、多態(tài)性片段(譜帶)數(shù)目及其比例、組內(nèi)和組間擴(kuò)增片段的相似系數(shù)、組間的遺傳距離[8]等各項(xiàng)參數(shù)，并對(duì)誘變子代的擴(kuò)增圖譜進(jìn)行比對(duì)(組內(nèi)和組間)，得到遺傳距離矩陣，通過擴(kuò)增位點(diǎn)的數(shù)量、多態(tài)率等參數(shù)評(píng)估誘變組與對(duì)照組之間的遺傳結(jié)構(gòu)。

遺傳距離等數(shù)據(jù)的有關(guān)計(jì)算公式如下：

相似系數(shù) Sij=2Nij/(Ni+Nj)

(1)

遺傳距離 D=-ln S

(2)

多態(tài)率 p=x/r

(3)

式中Nij為群體i與j共有的片段數(shù)量，Ni、Nj分別為群體i與j各自具有的片段數(shù)量；S為相似系數(shù)；x為具有多態(tài)性的位點(diǎn)，r為擴(kuò)增出來的總位點(diǎn)數(shù)。

數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2007進(jìn)行計(jì)算；利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 誘變子代的AFLP擴(kuò)增結(jié)果

本文共篩選了20對(duì)選擇性引物，并從中選擇了10對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)日本囊對(duì)蝦誘變子代5組40份模板DNA進(jìn)行AFLP擴(kuò)增，每個(gè)引物均能擴(kuò)增出重復(fù)性良好的特定擴(kuò)增產(chǎn)物，表現(xiàn)出一定程度的多態(tài)性。日本囊對(duì)蝦10對(duì)引物在分子量50 bp到2 000 bp之間共檢測(cè)出447個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)299個(gè)，占66.9%。引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為36～55個(gè)，平均44.7個(gè)。表1列出了10對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)誘變子代基因組DNA的擴(kuò)增情況。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙稀酰胺凝膠電泳后的結(jié)果如圖1所示。

表1 選擇性擴(kuò)增的引物序列及日本囊對(duì)蝦誘變子代基因組DNA的擴(kuò)增情況

續(xù)表1

注：M為50 bp DNA Ladder；1～8為誘變組4(1 500 cGy)；9～16為誘變組3(1 000 cGy)；17～24為誘變組2(100 cGy)；25～32為誘變組1(50 cGy)；33～40為對(duì)照組。

2.2 誘變子代各實(shí)驗(yàn)組遺傳相似系數(shù)及遺傳距離的分析結(jié)果

根據(jù)各位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無按1、0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，建立數(shù)據(jù)矩陣，計(jì)算遺傳相似系數(shù)、遺傳距離等參數(shù)，日本囊對(duì)蝦誘變子代各實(shí)驗(yàn)組遺傳相似系數(shù)的變化范圍從0.873 7(誘變組2組內(nèi)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)一直到0.894 7(誘變組4和對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。經(jīng)過單因素方差分析檢測(cè)其差異顯著性，發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)差異并不顯著，從群體水平來看，日本囊對(duì)蝦的誘變子代與正常對(duì)照組相比(P>0.05)，并沒有顯著的遺傳差異。表2列出了日本囊對(duì)蝦對(duì)照組和各誘變組組內(nèi)及組間的遺傳相似系數(shù)與遺傳距離數(shù)據(jù)，圖2為利用UPGMA法得到的遺傳距離聚類圖。

表2 日本囊對(duì)蝦誘變子代各實(shí)驗(yàn)組的遺傳相似系數(shù)(上三角)和遺傳距離(下三角)

注：1為對(duì)照組；2為誘變組1(50 cGy)；3為誘變組2(100 cGy)；4為誘變組3(1 000 cGy)；5為誘變組4(1 500 cGy)。

2.3 誘變子代各實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)的影響分析

隨機(jī)采集日本囊對(duì)蝦誘變子代各實(shí)驗(yàn)組樣本各30尾，在電子分析天平上進(jìn)行體質(zhì)量稱量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(表3)，作圖在Microsoft Excel 2007進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明對(duì)照組的生長(zhǎng)是各實(shí)驗(yàn)組中生長(zhǎng)速度最快的一組，且對(duì)照組與誘變組4(1 500 cGy)的生長(zhǎng)速度具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 日本囊對(duì)蝦誘變子代在土池培育90 d各實(shí)驗(yàn)組平均體質(zhì)量

續(xù)表3

3 討論

輻射對(duì)生物遺傳的影響表現(xiàn)在多個(gè)方面，包括DNA單鏈斷裂、雙鏈斷裂、堿基的損傷、DNA與DNA交聯(lián)及DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)等，能夠有效地增加種群的遺傳多樣性水平，結(jié)合人工選育技術(shù)可篩選出符合人們生產(chǎn)需要的新品種或新品系[9]。1927年Muller首次報(bào)道了X射線能夠誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生大量多變類型的突變，其后大量研究以農(nóng)作物為對(duì)象開展起來[10]，現(xiàn)階段誘變育成的作物品種中使用60Co-γ射線輻照的占75.0%～84.2%[11]?，F(xiàn)在，輻射開始被應(yīng)用在水生生物的遺傳選育當(dāng)中[12-13]。

AFLP即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragments length polymorphism)技術(shù)，是當(dāng)前檢測(cè)遺傳多樣性較有效的手段之一[14]，人們僅需要少量的DNA就可以提供極為豐富的遺傳信息。AFLP技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物的種系與個(gè)體鑒別、基因定位克隆，以及種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的研究[15-18]。本研究的AFLP擴(kuò)增結(jié)果說明了AFLP是一種能夠有效檢測(cè)種群內(nèi)遺傳差異的分子標(biāo)記技術(shù)。

本文利用大量基因位點(diǎn)的遺傳信息研究輻射誘變引起的遺傳差異，根據(jù)Nei M等[6]的報(bào)道，當(dāng)基因位點(diǎn)足夠多時(shí)僅用1個(gè)樣本代表這個(gè)分類單元得到的系統(tǒng)發(fā)育圖都是可信的。本文的研究結(jié)果表明，日本囊對(duì)蝦誘變子代各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)及組間的遺傳相似系數(shù)及遺傳距離的差異并不顯著(P>0.05)，利用UPGMA法對(duì)日本囊對(duì)蝦誘變子代各實(shí)驗(yàn)組遺傳距離的平均值進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組之間遺傳距離的差異都小于0.01。但是，在每對(duì)引物擴(kuò)增出的基因型(單個(gè)個(gè)體擴(kuò)增譜帶的組合型式)在誘變組中發(fā)現(xiàn)有部分個(gè)體的基因型和其他個(gè)體的基因型具有較為明顯的差異，而在對(duì)照組中并沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。結(jié)合筆者已發(fā)表的有關(guān)日本囊對(duì)蝦在無節(jié)幼體階段的論文中相應(yīng)遺傳相似系數(shù)和遺傳距離具有較為顯著的差異這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來分析[5]，認(rèn)為經(jīng)過輻射誘變處理后產(chǎn)生變異的個(gè)體在生長(zhǎng)過程中其體內(nèi)的自我修復(fù)機(jī)制可能會(huì)對(duì)產(chǎn)生變異的基因序列進(jìn)行修復(fù)，在無法修復(fù)時(shí)甚至可能造成個(gè)體的死亡。因此，結(jié)合人工選育技術(shù)對(duì)少數(shù)變異個(gè)體進(jìn)行選擇以建立生物新品系，增加群體的遺傳多樣性以豐富種質(zhì)資源，顯得尤為重要[19]。

日本囊對(duì)蝦誘變子代在土池培育90 d，各實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)速度的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的生長(zhǎng)速度在各實(shí)驗(yàn)組中最快，且對(duì)照組與誘變組4(1 500 cGy)的生長(zhǎng)速度具有顯著性差異(P<0.05)。但是，對(duì)照組組內(nèi)個(gè)體之間生長(zhǎng)速度的差異就要明顯小得多(P>0.05)，沒有出現(xiàn)這種個(gè)體體質(zhì)量差異懸殊的現(xiàn)象。

從分子水平上對(duì)生物遺傳物質(zhì)的變異進(jìn)行評(píng)估是一種研究60Co-γ射線輻射誘變效應(yīng)的現(xiàn)代技術(shù)，為進(jìn)一步研究生物的自我修復(fù)系統(tǒng)與遺傳變異之間平衡的生物學(xué)機(jī)制提供了方法[20]。本研究由于遺傳背景信息的缺乏，AFLP技術(shù)具有能夠快速有效地分析群體遺傳差異的特點(diǎn)，為本文提供了比較充分的分子生物學(xué)證據(jù)[21]。本研究證實(shí)將60Co-γ射線應(yīng)用于日本囊對(duì)蝦的誘變育種，還需要解決經(jīng)過誘變后的個(gè)體在生長(zhǎng)過程中不斷進(jìn)行修復(fù)、甚至死亡的問題，以保證能夠得到大量的變異個(gè)體，通過人工選育，從而為產(chǎn)業(yè)提供具有優(yōu)良性狀的新品種或新品系。將來，可以進(jìn)一步將特殊個(gè)體分子標(biāo)記的條帶從凝膠上切割下來，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，并將其發(fā)展成為STS(Sequence target site)標(biāo)記，結(jié)合人工選育手段，形成分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)，以期快速地對(duì)種群進(jìn)行遺傳選育工作。