馬鈴薯瘡痂病菌分離鑒定與抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果研究

張鉉哲，陳 梅，趙 雪，任雪琦，徐浩然，陳蘇慧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

鏈霉菌是土壤腐生菌，具有產(chǎn)生生物活性次級(jí)代謝物能力，特別是抗生素以及一些細(xì)胞外水解酶和其他化合物。僅有少數(shù)鏈霉菌具有植物致病性，引起馬鈴薯、蘿卜、胡蘿卜、甜菜和甘薯等多種作物根部病害[1-2]。

馬鈴薯瘡痂?。≒otato common scab，PCS）是由多種植物致病性鏈霉菌引起的一種全球性重要病害。在馬鈴薯生產(chǎn)中除馬鈴薯晚疫病外，PCS降低塊莖品質(zhì)，導(dǎo)致薯皮粗糙，影響種薯生產(chǎn)、鮮薯銷售和加工[2-3]。Streptomycesscabies、S.acidiscabies和S.turgiscabies被認(rèn)為是引起馬鈴薯瘡痂病最普遍病原菌[4]。塊莖細(xì)胞未木栓化幼嫩皮孔易受感染，所以致病鏈霉菌在馬鈴薯塊莖快速膨大期間易侵入[5]。PCS為土傳病害，由于土壤環(huán)境復(fù)雜性以及土壤顆粒機(jī)械保護(hù)作用，為該病害防治增加難度?，F(xiàn)階段防治瘡痂病最有效管理策略為種植健康無病抗病品種，并結(jié)合化學(xué)殺菌劑防治。然而，目前無有效防治瘡痂病化學(xué)殺菌劑。由此可見，馬鈴薯瘡痂病防治成為生產(chǎn)和育種過程中亟待解決問題。

抗病誘導(dǎo)劑可誘發(fā)植物自身免疫系統(tǒng)，最終使植物獲得抵御病害能力，保護(hù)植物免受病原物侵害，也減少化學(xué)農(nóng)藥使用[6]。目前有多種抗病誘導(dǎo)劑用于防治馬鈴薯瘡痂病，龔秀會(huì)等研究表明，使用誘抗劑BTH抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有較好防治效果，最佳防效達(dá)63.59%[7]。目前水楊酸（Salicylic acid，SA）在馬鈴薯瘡痂病防治上報(bào)道較多，湯曉莉等研究表明，施用外源SA增強(qiáng)植株對(duì)瘡痂病系統(tǒng)抗性，顯著降低種薯感病率[8]。王宏虬等在結(jié)暑期至成熟期定期用SA葉面噴施，結(jié)果表明，可有效提高植株對(duì)瘡痂病抗性[9]。草酸（Oxalic acid，OA）、β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MJ）分別在誘導(dǎo)植株對(duì)黃瓜霜霉病[10]、馬鈴薯晚疫病[11]和辣椒青枯病[12]等病害上應(yīng)用廣泛，但在馬鈴薯瘡痂病防治上未見報(bào)道。為選出對(duì)馬鈴薯瘡痂病具有良好誘抗效果抗病誘導(dǎo)劑，本研究采用5種抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯植株葉面噴霧，誘導(dǎo)馬鈴薯對(duì)瘡痂病抗病性，并測定各抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量影響以及對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果，以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供新防治依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)e?SO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。用于菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)物。

ISP2培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，麥芽糖提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2~7.4。用于菌株分離和常規(guī)培養(yǎng)。

供試誘抗劑：草酸、水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MJ）、3-氨基丁酸（BABA）、2,1,3-苯并噻二唑（BTH）（化學(xué)純），均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，12%中生菌素可濕性粉劑由福建凱立生物制品有限公司提供。

供試馬鈴薯品種：大西洋。

1.2 病樣采集與菌株分離

病原菌采集與分離：2020年馬鈴薯收獲期間，于黑龍江省哈爾濱市采集患瘡痂病薯塊。采用稀釋分離法分離病原菌。首先用清水沖洗病薯并晾干，無菌刀切取病健交界處置于75%酒精內(nèi)消毒，無菌水漂洗3次。漂洗完畢后，分別置于無菌研缽中加入少量蒸餾水研磨成勻漿，靜置0.5 h使病原菌充分釋放至溶液中。4層無菌紗布過濾，并對(duì)濾液稀釋為10-1、10-2、10-3，分別吸取稀釋液30μL涂布于ISP2培養(yǎng)基平板上。涂板之前將均質(zhì)樣品55℃熱處理3 min以抑制增長迅速細(xì)菌。7 d后，選擇白色粉狀單菌落，采用劃線法純化3次，將純化后菌株編號(hào)，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌株致病性鑒定

參照Loria等方法[13]，鏈霉菌屬用馬鈴薯塊莖切片法評(píng)價(jià)瘡痂病感病品種大西洋致病性。塊莖用0.5%NaOCl消毒后切成塊莖盤（直徑1.5 cm，厚度3 mm），置于培養(yǎng)皿中潤濕無菌濾紙。在28℃條件下，將菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d。將產(chǎn)孢菌落打成7 mm菌餅，將菌餅含菌一側(cè)緊貼于塊莖盤上。每個(gè)處理3次重復(fù)，接種未接菌瓊脂塊為空白對(duì)照。28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后，檢測所有塊莖切片，觀察并統(tǒng)計(jì)馬鈴薯切片是否變褐，若變褐則該菌即具有致病性。

1.3.2 致病菌形態(tài)觀察和生物學(xué)特性測定

菌株形態(tài)觀察：在ISP2培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)特征和色素顏色。用蓋玻片輕壓長滿孢子鏈霉菌菌落，并用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲及孢子鏈形態(tài)，根據(jù)病原菌形態(tài)特征，鑒定病原菌。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》[14]。

生物學(xué)特性測定：菌株碳源、氮源、H2S、纖維素分解、黑色素產(chǎn)生等生物學(xué)特性測定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》[14]。

1.3.3 致病菌分子鑒定

基因組DNA提?。翰捎脛⒈x等方法中優(yōu)化SDS法提取DNA[15]。

序列PCR擴(kuò)增及同源性分析：鏈霉菌16SrD?NA通用引物序列為：PrimerA：5'CATTCACGGAG AGTTTGATCC 3'，PrimerB：5'AGAAAGGAGGTG ATCCAGCC 3'。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。對(duì)所得序列于NCBI作Blast比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件作多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果

1.4.1 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌離體作用

將菌株于高氏1號(hào)培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)7d，用少量無菌水洗下病菌孢子，分裝至離心管中5000r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入無菌水將孢子濃度調(diào)節(jié)至108CFU·mL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用無菌水將草酸、BABA、BTH、SA和MJ分別配制成5、10、20、50和100μg·mL-15個(gè)濃度，以清水處理為空白對(duì)照。采用紙碟法，將配置好菌懸液取100μL均勻涂布于瓊脂平板上，將圓形濾紙片（d=0.6 cm）分別用上述濃度誘導(dǎo)劑浸濕，置于瓊脂平板中央，每個(gè)濃度重復(fù)3次，28℃條件下暗培養(yǎng)7 d，觀察是否形成抑菌圈。

1.4.2 抗病誘導(dǎo)劑田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2019年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)站開展，播種地前茬作物為馬鈴薯，且馬鈴薯瘡痂病發(fā)生嚴(yán)重。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)7個(gè)處理，每小區(qū)面積為18 m（23 m×6 m），各處理3次重復(fù)。采用壟作方法種植，各小區(qū)常規(guī)除草、中耕和施肥。精選健康無病且均勻一致馬鈴薯種薯，0.5%NaClO浸泡3 min表面消毒后，無菌水清洗晾干，再用10 mg·L-1赤霉素溶液浸泡30 min，將塊莖置于室內(nèi)保溫催芽。出芽后然后將塊莖切成含2~3個(gè)芽眼薯塊，置于室內(nèi)通風(fēng)處2 d后播種。

5種抗病誘導(dǎo)劑施用濃度為50μg·mL-1，以殺菌劑12%中生菌素400μg·mL-1為藥劑對(duì)照，以施用清水為空白對(duì)照。田間馬鈴薯出苗25 d后開始使用藥劑，將抗病誘導(dǎo)劑均勻噴施到馬鈴薯植株葉面上，噴施程度為葉片無液滴滴落為止。中生菌素模擬灌溉處理，每株200 mL，每隔7 d施用1次，共施用4次。最后1次施用藥劑間隔7 d后，各小區(qū)采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)采樣點(diǎn)選取4株馬鈴薯，每小區(qū)共采集20株。調(diào)查測定各處理馬鈴薯產(chǎn)量，包括大中薯質(zhì)量（大中薯≥50 g）、小薯質(zhì)量（<50 g），計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

薯塊瘡痂病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：薯皮健康，無病斑；Ⅰ級(jí)：薯皮基本健康，所占面積未超薯皮表面積1/4；Ⅱ級(jí)：所占面積為薯皮表面積1/4~1/3；Ⅲ級(jí)：所占面積占薯皮面積1/3~1/2；Ⅳ級(jí)：嚴(yán)重感病，病斑面積超過薯皮表面積1/2。

發(fā)病率（%）=每小區(qū)發(fā)病種薯粒數(shù)/每小區(qū)收獲種薯粒數(shù)×100；

病情指數(shù)（%）=∑（各級(jí)病薯數(shù)×該病級(jí)代表值）（/調(diào)查總薯塊數(shù)×最高級(jí)值）×100；

相對(duì)防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS7.05軟件，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀及病原菌分離鑒定

2.1.1 馬鈴薯瘡痂病癥狀

從馬鈴薯田采集患病薯塊癥狀表現(xiàn)為：馬鈴薯塊莖表皮形成瘡痂病斑，發(fā)病部位為木栓化褐色病斑，病斑產(chǎn)生裂痕，病斑形狀不規(guī)則，呈點(diǎn)狀或連片分布，使塊莖表面變得粗糙且凹凸不平，塊莖發(fā)病癥狀如圖1A所示。

2.1.2 菌株致病性測定

將測試菌株菌餅接種至小薯片上，7 d后觀察測試菌株在小薯片上生長情況，且小薯片表面均產(chǎn)生褐色壞死，對(duì)照未產(chǎn)生褐變現(xiàn)象。經(jīng)測定，14株鏈霉菌中共獲得致病菌株9株，致病菌占比為64.3%，各菌株接種小薯片發(fā)病率均為100%，菌株致病癥狀如圖1B、C所示。

2.1.3 菌株分離和形態(tài)觀察

觀察致病菌株形態(tài)得出，各致病菌株在ISP2培養(yǎng)基平板上宏觀和顯微形態(tài)相同，均為菌落灰色，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，菌落上方形成褶狀隆起，孢子灰色，孢子鏈直鏈狀（見圖2）。

圖1 馬鈴薯瘡痂病癥狀圖及鏈霉菌致病癥狀Fig.1 Symptom of potato common scab and pathogenicity of isolates of Streptomyces spp.

圖2 鏈霉菌形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of Streptomyces

2.1.4 馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性測定

挑選代表性菌株HRB-20-9測定生物學(xué)特性，結(jié)果表明，該菌株以組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸、羥脯氨酸為單一氮源，以甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇為單一碳源，對(duì)20μg·mL-1鏈霉素、0.1%苯酚、0.5μg·mL-1結(jié)晶紫敏感，對(duì)10 IU·mL-1青霉素不敏感，在特定培養(yǎng)基中產(chǎn)生黑色素和H2S，產(chǎn)生淀粉酶使淀粉水解，符合S.scabies生理生化特征（見表1）。

2.1.5 致病菌株分子鑒定

采用16SrDNA引物作PCR擴(kuò)增測序，在NCBI中作Blast比對(duì)，選取與測試菌株相似性較高序列和鏈霉菌典型菌株，利用MEGA 7.0作序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，HRB-20-9與S.scabies同源性較高（見圖3）。結(jié)合生物學(xué)特性將該菌株鑒定為S.scabies。

2.2 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)致病鏈霉菌離體作用

通過紙碟法測定5、10、20、50、100μg·mL-1誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌HRB-20-9離體作用，結(jié)果表明，不同濃度抗病誘導(dǎo)劑對(duì)致病鏈霉菌均未出現(xiàn)抑菌圈（見圖4），說明抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌無直接殺滅作用。

表1 馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性Table 1 Characteristics of potato common scab strains

圖3 HRB-20-9菌株16Sr DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16Sr DNA sequencephylogenetic tree of HRB-20-9 strain

2.3 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量的影響

田間對(duì)各抗病誘導(dǎo)劑和殺菌劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量影響結(jié)果測定結(jié)果表明（見表2），產(chǎn)量為38 220~39 975 kg·hm-2內(nèi)波動(dòng)，各處理間無顯著差異，說明5種誘導(dǎo)劑均對(duì)鈴薯產(chǎn)量無影響。

2.4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果

抗病誘導(dǎo)劑和殺菌劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果調(diào)查結(jié)果表明，各抗病誘導(dǎo)劑及中生菌素對(duì)馬鈴薯瘡痂病均有一定防治效果（見表3），可減少瘡痂病發(fā)病率，其中MJ處理發(fā)病率最低，為82.4%，與清水對(duì)照相比降低17.6%。與使用殺菌劑中生菌素相比，SA和MJ防治效果菌顯著高于中生菌素，其中MJ防治效果最佳，防效達(dá)43.6%。其次是SA，防效為38.1%，而草酸和BABA防效相對(duì)較差，顯著低于中生菌素，防效僅為23.7%和20.6%。

圖4 抗病誘導(dǎo)劑對(duì)HRB-20-9離體抑制作用Fig.4 Effects of different concentrations of disease resistant inducers on HRB-20-9 in vitro

表2 噴施不同誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different inducers on potato yield

表3 噴施不同抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病防治效果Table3 Control effect of spraying different diseaseresistanceinducerson potato common scab

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯瘡痂病是一種嚴(yán)重土傳病害，致病菌由多種鏈霉菌組成，且不同地區(qū)致病菌分布存在差異。目前甘肅報(bào)道的病原菌有瘡痂鏈霉菌（S.scabies）、灰色鏈霉菌（S.griseus）、鮑比氏鏈霉菌（S.bobili）和加利利鏈霉菌（S.galilaeus）[16-17]，河北地區(qū)致病菌有瘡痂鏈霉菌（S.scabies）、歐洲瘡痂鏈霉菌（S.europaeiscabiei）和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（S.diastatochromogenes）[18]，黑龍江哈爾濱市目前報(bào)道病原菌種有酸性瘡痂鏈霉菌（S.acidiscabies）和腫痂鏈霉菌（S.turgidiscabies）[19]。但未見S.scabies菌株報(bào)道。本研究從哈爾濱市采集具有典型瘡痂病癥狀馬鈴薯病斑上分離得到14株鏈霉菌，通過小薯片法測定發(fā)現(xiàn)9株（64.3%）具有致病性。根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特性測定將致病菌株鑒定為S.scabies，說明哈爾濱地區(qū)馬鈴薯瘡痂病致病菌有S.scabies。

采用紙碟法分別檢測草酸、SA、BABA、BTH、MJ對(duì)致病鏈霉菌生長影響。離體條件下不同濃度抗病誘導(dǎo)劑對(duì)病原菌未形成抑菌圈，說明誘抗劑對(duì)馬鈴薯致病鏈霉菌無毒殺作用，對(duì)馬鈴薯瘡痂病產(chǎn)生防治效果是其誘導(dǎo)馬鈴薯植株產(chǎn)生抗病性結(jié)果。田間試驗(yàn)中，使用5種抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯植株葉面噴施，研究表明不同誘導(dǎo)劑處理對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量無顯著影響，瘡痂病菌僅侵染馬鈴薯表皮層，并未造成馬鈴薯產(chǎn)量下降，也有研究表明，在瘡痂病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，引起馬鈴薯產(chǎn)量降低[20]。誘導(dǎo)劑使用均降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率，并取得一定防治效果，其中MJ防治效果最佳，發(fā)病率與清水對(duì)照相比降低17.6%，防效高于中生菌素對(duì)照藥劑，達(dá)43.6%。說明抗病誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)馬鈴薯植株對(duì)瘡痂病抗性，從而產(chǎn)生抵抗病原菌能力，降低發(fā)病率，提高馬鈴薯品質(zhì)。目前，OA、MJ和BABA在馬鈴薯瘡痂病防治研究中未見報(bào)道。已有報(bào)道用于防治馬鈴薯瘡痂病抗病誘導(dǎo)劑有SA和BTH。楊鑫等使用不同抗病誘導(dǎo)劑對(duì)馬鈴薯液面噴霧，結(jié)果表明不同誘導(dǎo)劑均降低瘡痂病發(fā)病率，其中SA防治效果達(dá)到43.98%[21]。湯曉莉等研究表明使用外源SA防治馬鈴薯瘡痂病，使馬鈴薯植株矮化，增強(qiáng)植株抗性，有效降低種薯感病率[8]。施用不同濃度誘抗劑BTH處理馬鈴薯植株，降低馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率和病情指數(shù)，濃度為1.00 mmol·L-1時(shí)，對(duì)瘡痂病相對(duì)防效高達(dá)63.59%[7]。而本研究中BTH防效較低，因此推斷其可能是由于使用劑量較低導(dǎo)致，其他使用劑量有待進(jìn)一步測定。王宏虬等開展馬鈴薯瘡痂病最適誘導(dǎo)劑篩選試驗(yàn)，最適抗病誘導(dǎo)劑為SA，其防效顯著高于BTH，這一趨勢與本研究結(jié)果一致[9]。

抗病誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物自身對(duì)外來病原物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這類物質(zhì)在較低濃度下即被植物識(shí)別，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性，從而抵御外來病原物侵染[22]。使用抗病誘導(dǎo)劑防治植物病害具有使用方便、有效、安全，對(duì)環(huán)境無副作用等特點(diǎn)[23]。因此抗病誘導(dǎo)劑可作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑和誘抗劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，有利于農(nóng)作物生長發(fā)育，降低植物病害發(fā)生率，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，提升農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究所選用5種抗病誘導(dǎo)劑中，MJ噴施馬鈴薯葉片防治效果最佳，可作為馬鈴薯瘡痂病最適誘抗劑，但本研究僅使用一個(gè)濃度，MJ使用最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。目前抗病誘導(dǎo)劑在馬鈴薯瘡痂病防治上的應(yīng)用較少，在后續(xù)研究中可將誘導(dǎo)劑與化學(xué)殺菌劑混合使用，并結(jié)合使用抗性品種，以期為馬鈴薯瘡痂病防治提供更有效防治措施。