野生袍樹芽中ω-3不飽和脂肪酸的提取及理化性質(zhì)

牛曉鳴，李強(qiáng)

呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院（呼倫貝爾 021000）

袍樹芽又稱樹頭菜、烏龍頭，是袍樹春天長出的“彈頭狀”幼芽，常見于甘肅定西、天水、隴西南地區(qū)，是一種食藥兩用的名貴野菜，在西北一帶享“野菜之王”美譽(yù)[1]。野菜袍樹芽屬于純天然綠色食品，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸及人體所需的多種氨基酸。袍樹芽還可入藥，除了是一種理想的減肥野生名菜以外，還具有增強(qiáng)人體心肌能力、活血化瘀、防濕冷潮氣、美容養(yǎng)顏等功效，因而在國內(nèi)外市場上廣受歡迎[2-3]。袍樹芽中的不飽和脂肪酸為ω-3系列脂肪酸，主要為α-亞麻酸和二十碳五烯酸（EPA），有不少學(xué)者參與對于不飽和脂肪酸的提取研究，王一兵等[4]采用超聲波細(xì)胞破碎和索式回流相結(jié)合的方法對馬尾藻總脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸進(jìn)行提取及成分分析；李妍等[5]采用超聲波提取法，以正交試驗(yàn)的方式對甘薯葉不飽和脂肪酸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件。此次試驗(yàn)采用超聲破壁-溶劑提取法對野生袍樹芽中的ω-3系列不飽和脂肪酸進(jìn)行提取，分析其組成成分，并對理化性質(zhì)進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 材料、試劑和儀器

袍樹芽（甘肅省武山縣金隴農(nóng)副產(chǎn)品有限公司）；無水乙醇（山東德彥化工有限公司）；石油醚（濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司）；KOH（常州市誠邦化工有限公司）；甲醇（河北翰林新能源科技有限公司）；稀鹽酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）。

JC-312馬弗爐（重慶市松郎電子儀器有限公司）；LX-800實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)（北京海天友誠科技有限公司）；SCIENTZ-1200E超聲波細(xì)胞破碎儀（北京海天友誠科技有限公司）；碘量瓶（上海壘固儀器有限公司）；密度瓶（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；JH500全自動折光儀（上海佳航儀器儀表有限公司）；PXB-10型遠(yuǎn)紅外加熱器（江蘇澎興博實(shí)業(yè)有限公司）；GC-MS6800型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（蘇州軒沃瑞智能科技有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度儀（深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 ω-3不飽和脂肪酸的提取[6-7]

將袍樹芽外層剝除后，選取內(nèi)層的新鮮嫩芽為原料。將原料剪碎后用去離子水清洗去雜，采用遠(yuǎn)紅外加熱器快速處理使袍樹芽中的蛋白質(zhì)失活，冷卻后用研缽研磨，加入適量無水乙醇后過孔徑0.150 mm篩，使用超聲波細(xì)胞破碎儀對樣品進(jìn)行超聲破壁。加入足量的石油醚，在60 ℃水浴條件下提取8 h，過濾后將濾液蒸餾，加入飽和的KOH-甲醇溶液（0.1 mol/L）皂化，之后加入稀鹽酸（0.01 mol/L）調(diào)節(jié)pH約3.0。加入50 mL去離子水，待溶液分層后離心分離上層油層即得ω-3不飽和脂肪酸。

1.3 試驗(yàn)相關(guān)測定

1.3.1 不飽和脂肪酸成分

采用GC-MS6800型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。氣相色譜檢測條件：柱溫220 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，N2載氣流速2.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測器FID溫度280 ℃。

1.3.2 pH對不飽和脂肪酸穩(wěn)定性的影響

分別用0.1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH，30 min后在暗室條件下測其最大波長處的吸光度。

1.3.3 灰分

將坩堝洗凈后高溫焙燒，冷卻至室溫時(shí)稱質(zhì)量，計(jì)為m1，放入100 mL提取的ω-3不飽和脂肪酸溶液，于80 ℃真空烘箱蒸除溶劑，并稱重計(jì)，為m0，放入馬弗爐中高溫焙燒至質(zhì)量不再改變，計(jì)為m2，則灰分按式（1）計(jì)算。

1.3.4 ·OH清除能力

參考文獻(xiàn)[8]，采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，用Griess試劑作為顯色劑?！H清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品顯色時(shí)的吸光度。

1.3.5 DPPH·清除能力

參考文獻(xiàn)[9]，采用無水乙醇配制不同濃度的ω-3不飽和脂肪酸。取2 mL DPPH·溶液分別加入具塞試管中，各具塞試管加入同體積不同濃度待測溶液，于暗室反應(yīng)完全后，在528 nm波長處測定吸光度。DPPH·清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A0為2 mL DPPH溶液+無水乙醇溶液的吸光度；A1為2 mL DPPH溶液+待測溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇+待測溶液的吸光度。

1.3.6 理化性質(zhì)的測定

酸值參照GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度的測定》測定；碘值參照GB/T 5532—1995《植物油碘值測定》測定；折光系數(shù)參照GB/T 614—2006《化學(xué)試劑折光率測定通用方法》，采用JH-WYA25數(shù)顯折光儀測定；相對密度參照GB/T 5526—1985《植物油脂檢測比重測定法》，采用密度瓶測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不飽和脂肪酸的GC-MS分析

圖1為試驗(yàn)從袍樹芽中所提取的ω-3不飽和脂肪酸的氣相色譜圖，經(jīng)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析結(jié)果可知，ω-3不飽和脂肪酸的主要組成成分為α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳四烯酸和十八碳三烯酸，其含量分別為41.3%，22.7%，17.6%，14.7%和8.3%?？傮w而言，ω-3系列的不飽和脂肪酸總含量超過80%，純度較高，后續(xù)的試驗(yàn)測定與分析發(fā)現(xiàn)提取液中的雜質(zhì)并不影響試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)效果良好。

圖1 不飽和脂肪酸的總離子流色譜圖

2.2 理化性質(zhì)分析

2.2.1 pH對溶液吸光度的影響

由表1可知，不飽和脂肪酸溶液隨著pH增大而顏色加深并趨向紅色發(fā)展，在酸性范圍內(nèi)表現(xiàn)為黃色及橙色，在堿性范圍內(nèi)由橙色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。吸光度也隨pH變化而影響較大，吸光度極差值達(dá)到0.36，說明溶液pH對不飽和脂肪酸分子的穩(wěn)定性影響較大，pH由酸性變化為堿性區(qū)間，ω-3系列不飽和脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，為保持分子結(jié)構(gòu)不受影響，應(yīng)保持在pH 2～4范圍內(nèi)。

表1 pH對不飽和脂肪酸吸光度的影響

2.2.2 皂化過程對于溶液灰分的影響

采用KOH-甲醇溶液與提取液中的油脂之間發(fā)生皂化反應(yīng)，一方面可以解脫大分子油脂由于與不飽和脂肪酸的親和度較高，往往會互相結(jié)合而無法分離，致使不飽和脂肪酸的提取率較低，純度不高的現(xiàn)象發(fā)生；另一方面通過KOH的堿性調(diào)節(jié)，溶液體系環(huán)境呈堿性，容易使得溶液中的金屬離子（Fe3+、Mg2+、Zn2+）沉淀，后續(xù)流程易于分離而提高ω-3不飽和脂肪酸溶液的純度。具體到KOH-甲醇溶液濃度影響溶液理化性質(zhì)——灰分的表現(xiàn)如圖2所示。起始階段沒有KOH-甲醇溶液的皂化反應(yīng)時(shí)，溶液中由于金屬離子的存在而使得灰分較高，加入皂化工藝處理之后，溶液中灰分明顯下降，同時(shí)意味著不飽和脂肪酸純度有所上升?？紤]到加入的KOH-甲醇溶液濃度過大反而會使得灰分上升，故而確定KOH-甲醇溶液濃度為0.1 mol/L。

圖2 KOH-甲醇溶液對提取液灰分的影響關(guān)系曲線

2.2.3ω-3不飽和脂肪酸的抗氧化活性

對ω-3不飽和脂肪酸抗氧化活性的考察分為DPPH·清除能力和·OH清除能力2個(gè)方面。不飽和脂肪酸對DPPH·清除能力曲線如圖3所示，濃度0.05～0.3 mol/L范圍時(shí)，DPPH·清除率隨著不飽和脂肪酸濃度增大而迅速增大，濃度0.4 mol/L時(shí)，清除率達(dá)到74.3%，不飽和脂肪酸在石油醚中的最大溶解濃度約0.4 mol/L，此時(shí)提取液的吸光度基本達(dá)到最大，同時(shí)對DPPH·的清除能力亦達(dá)到最大。

圖3 不飽和脂肪酸對DPPH·清除率的關(guān)系曲線

ω-3不飽和脂肪酸對·OH的清除效果如圖4所示，提取液對·OH的清除率隨著自身濃度增大而增大，不飽和脂肪酸達(dá)到最大溶解濃度0.4 mol/L時(shí)，其對·OH清除率達(dá)到57.1%。

圖4 不飽和脂肪酸對·OH清除率的關(guān)系曲線

2.2.4 其他理化性質(zhì)

ω-3不飽和脂肪酸提取液的其他理化性質(zhì)如表2所示。石油醚提取的不飽和脂肪酸的酸值較低，說明提取液受到的氧化作用程度較低，活性保存度較好從而使得品質(zhì)上得到保證。碘值較高，超過120.0 g I2/g[10]，說明脂肪酸的不飽和程度較高，性質(zhì)上歸屬于半干性油脂的脂肪酸。折光系數(shù)較高則側(cè)面反映提取液中的不飽和脂肪酸濃度較大，同時(shí)相對密度較大也佐證這一試驗(yàn)事實(shí)。

表2 ω-3不飽和脂肪酸的其他理化性質(zhì)

3 結(jié)論

以甘肅省武山縣產(chǎn)野生袍樹芽為原料，采用超聲破壁-溶劑提取法提取其中的ω-3系列不飽和脂肪酸，對提取的不飽和脂肪酸進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明ω-3不飽和脂肪酸的主要組成是α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳四烯酸和十八碳三烯酸，其含量分別為41.3%，22.7%，17.6%，14.7%和8.3%，總含量超過80%。試驗(yàn)主要對提取液的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，pH通過影響不飽和脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)來影響溶液的穩(wěn)定性，經(jīng)探討，溶液應(yīng)保持在pH 2～4范圍內(nèi)較為合理。皂化工藝可以有效減少灰分，提高提取液中ω-3不飽和脂肪酸純度，確定KOH-甲醇溶液濃度為0.1 mol/L。試驗(yàn)從對DPPH·的清除能力和·OH的清除能力2個(gè)方面進(jìn)行不飽和脂肪酸抗氧化活性的探討，不飽和脂肪酸在石油醚中的最大溶解濃度約0.4 mol/L，此時(shí)對DPPH·和·OH的清除能力達(dá)到最大，清除率分別為74.3%和57.1%。其他理化性質(zhì)的測定結(jié)果分別為酸值（1.23±0.05）mg KOH/g，碘值（143.75±0.05）g I2/g，折光系數(shù)1.38，相對密度0.92。從對提取液的各項(xiàng)理化指標(biāo)綜合來看，ω-3不飽和脂肪酸純度較高，理化性能表現(xiàn)良好。