高速逆流色譜技術(shù)在中藥及天然產(chǎn)物中的應(yīng)用研究*

彭詩濤，劉振麗，宋志前，王 淳，梁東蕊，萬曉瑩，宋 超，寧張弛△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100069)

中醫(yī)復(fù)方發(fā)揮治療作用與其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)密切相關(guān)，開展藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，對解釋方藥配伍規(guī)律、評估臨床療效具有重大意義[1]。中醫(yī)復(fù)方中包含中藥化學(xué)成分種類繁多、含量懸殊，給藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]，故采用必要的成分分離手段，是開展藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的途徑之一。高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種高效連續(xù)的液-液分配色譜技術(shù)，其利用互不相溶的兩相溶劑在螺旋管中高速行星式的運(yùn)動(dòng)，使分離物質(zhì)在兩相之間多次分配，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分快速高效的分離及制備[3]。液體固定相相較于固體固定相克服了對成分的吸附和污染問題，有效避免了活性成分的分解與失活。同時(shí)，HSCCC技術(shù)的操作條件溫和、過程快速，具有成分不變性和無損失的優(yōu)勢。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，早期HSCCC技術(shù)已難以滿足復(fù)雜成分分離的需求，技術(shù)創(chuàng)新出現(xiàn)在HSCCC應(yīng)用的各個(gè)環(huán)節(jié)，如溶劑體系、洗脫方式、檢測技術(shù)以及與其他提取技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用等(圖 1)。這些技術(shù)革新為單體成分分離、化學(xué)組分分析及活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了有力的技術(shù)支撐，從而拓展了HSCCC技術(shù)的應(yīng)用空間，使得越來越多的中藥及天然產(chǎn)物組分得以分離、活性成分得以發(fā)現(xiàn)。為使該技術(shù)更好地應(yīng)用于中醫(yī)復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，本文對相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)行了歸納總結(jié)。

圖1 高速逆流色譜技術(shù)提升研究圖示

1 溶劑體系的改進(jìn)

采用HSCCC技術(shù)對成分進(jìn)行分離，首先要根據(jù)待分離成分的極性、溶解度等性質(zhì)預(yù)選幾個(gè)溶劑體系，然后通過薄層色譜法、高效液相色譜法等測定成分在體系中的分配系數(shù)，從而確定最佳的溶劑體系[4]。早期HSCCC技術(shù)通常采用兩相溶劑體系，即將幾種試劑按一定比例混合后形成上下兩相；而后期三相溶劑體系的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了更多單體成分的分離。三相溶劑體系是由上、中、下三相組成，一般采用其中兩相作為流動(dòng)相，第三相作為固定相，或采用其中的兩相分別作為固定相和流動(dòng)相。

如Wu等[5]采用三相體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上相/下相、上相/中相及中相/下相體系，成功分離了白芷、高良姜、知母中的水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素等17個(gè)成分。Ito等[6]采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的上、中、下三相，組合成不同的溶劑體系，實(shí)現(xiàn)了從色氨酸到β-胡蘿卜素的大跨度極性范圍標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分離。另有采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的中相為流動(dòng)相，下相為固定相分離蘋果屬植物中的極性低聚物兒茶素的報(bào)道[7]。為建立不同極性維生素類成分的分離方法，通過以正己烷-甲基叔丁基醚-乙腈-水(5∶5∶7.5∶5，v/v/v/v)的上相為流動(dòng)相、中相為固定相，實(shí)現(xiàn)了脂溶性維生素的分離；同時(shí)使用上述溶劑體系的下相為流動(dòng)相、中相為固定相，分離得到水溶性維生素成分[8]。Yanagida等[9]運(yùn)用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)三相體系，分離得到兒茶素、咖啡因等多個(gè)天然產(chǎn)物提取物的二級代謝產(chǎn)物成分。水黃皮中黃酮類化合物的分離以正己烷-乙腈-二氯甲烷-水(5∶5∶1∶5，v/v/v/v)體系中不同比例中相和下相混合溶劑(0.3∶0.7、0.1∶0.9，v/v)為固定相，上相為流動(dòng)相，或以下相為固定相，上相為流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)[10]。報(bào)道顯示，三相溶劑體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(3∶6∶5∶5，v/v/v/v)可被用于蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯的快速富集和分離[11]。Kamto等[12]通過調(diào)整固定溶劑體系中有機(jī)溶劑與水的比例，實(shí)現(xiàn)了鏈莢木屬植物中多種成分的分離。另有采用三相溶劑系統(tǒng)正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水(7∶3∶5∶5，v/v/v/v)從鏈霉菌中提取大環(huán)酯類抗生素巴佛洛霉素A1的報(bào)道[13]。有學(xué)者比較了多種溶劑體系對乳香中乳香酸類成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)三相溶劑體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上中兩相，對于極性小且極性相近的乳香酸類成分的分離能力明顯優(yōu)于兩相溶劑體系，最終分離得到18個(gè)乳香酸單體成分[14]。

此外，某些特殊試劑也在溶劑體系中起到特殊作用。如雙重手性選擇劑Cu(II)-1-丁基-3-甲基咪唑-[L-脯氨酸]與羥丙基-β-環(huán)糊精用于柚皮素的手性分離[15]。離子對試劑七氟丁酸的添加實(shí)現(xiàn)了千日紅中β-花青苷的分離[16]。

溶劑系統(tǒng)的選擇是采用HSCCC技術(shù)分離中藥及天然產(chǎn)物的核心步驟，同時(shí)也是難度最大的環(huán)節(jié)。Ito法、HBAW法和ARIZONA法是經(jīng)典的多元溶劑體系的選擇方法，此外還有基于溶劑極性的分類選擇方法，但這些方法多針對兩相溶劑體系，在溶劑的選擇范圍方面還存在一定的局限性。近年來，三相溶劑的發(fā)明擴(kuò)展了溶劑的選擇范圍，兼顧了更多化學(xué)成分的性質(zhì)，大大節(jié)約了溶劑的使用量，對于多種化學(xué)成分的快速分離發(fā)揮了重大作用。特殊試劑的加入滿足了特殊化學(xué)基團(tuán)成分的分離，但三相溶劑體系和特殊試劑的使用尚缺乏系統(tǒng)的理論指導(dǎo)。

2 洗脫方式的提升

中藥及天然產(chǎn)物中化學(xué)成分?jǐn)?shù)量眾多，傳統(tǒng)的HSCCC技術(shù)多采用線性洗脫方式，但該方式對于結(jié)構(gòu)相似成分的分離效果欠佳。學(xué)者們通過采用梯度洗脫、內(nèi)循環(huán)洗脫以及兩步洗脫等溶劑泵洗脫改進(jìn)方式，使HSCCC在成分分離中發(fā)揮了更大作用。

據(jù)報(bào)道，有學(xué)者通過對正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系比例和洗脫方式的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了葡萄屬中性質(zhì)相近的二苯乙烯苷類低聚物的分離[17]。研究者通過改進(jìn)線性洗脫和梯度洗脫的兩步洗脫方式，實(shí)現(xiàn)了芒果花中沒食子酸及櫚酸乙酯2個(gè)酚性成分的分離[18]。利用六通閥的切換使得洗脫時(shí)間和距離延長，可有利于海棠葉中多酚類成分的分離[19]。Song等[20]結(jié)合線性洗脫以及內(nèi)循環(huán)2種洗脫方式，對番荔枝葉中的黃酮苷類成分進(jìn)行了分離，以線性洗脫方式分離了分配系數(shù)相差較遠(yuǎn)的成分，以內(nèi)循環(huán)洗脫方式分離了分配系數(shù)相近的成分。

洗脫方式的技術(shù)提升，大大擴(kuò)展了HSCCC技術(shù)在中藥及天然產(chǎn)物分離方面的應(yīng)用。針對化合物本身的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征以及多種化學(xué)成分之間的差異，學(xué)者們可以根據(jù)不同的分離需求靈活地對溶劑配比及洗脫時(shí)間進(jìn)行設(shè)定。循環(huán)洗脫方式的出現(xiàn)，在延長洗脫時(shí)間的同時(shí)也大大節(jié)省了溶劑的使用，使得化學(xué)成分的分離實(shí)驗(yàn)更加環(huán)保和綠色。

3 檢測技術(shù)的提升

早期HSCCC技術(shù)連接最多的是紫外檢測器，但該檢測器對吸收較弱或無紫外吸收的成分檢測效果微乎其微。后期質(zhì)譜、傅立葉紅外光譜、蒸發(fā)光散射以及示差折光等檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，拓展了HSCCC技術(shù)的使用范圍。同時(shí)，HSCCC技術(shù)與液相色譜分離技術(shù)的結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)了對化學(xué)成分的分離與分析能力。

據(jù)報(bào)道，采用分析型HSCCC與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分離純化得到了木蝴蝶乙酸乙酯部位的鞣花酸和乙基棓酸[21]。HSCCC連接電噴霧質(zhì)譜檢測器，通過搭建餾分收集器和檢測器之間的T型分流裝置，并根據(jù)進(jìn)樣量選擇恰當(dāng)?shù)姆至鞅龋瑥牟枞~中分離到原兒茶酸和黃酮苷類等多種多酚類化合物[22]。為實(shí)現(xiàn)甜青檸中微量成分的分離和分析，采用HSCCC和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對目標(biāo)成分進(jìn)行分離與結(jié)構(gòu)鑒定，從而大大提高了成分的檢測靈敏度[23]。HSCCC與液相色譜-質(zhì)譜的聯(lián)用還被用于胡桃木中化學(xué)成分的分離和分析，該技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)成分的分離，還能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)構(gòu)鑒定與檢測成分純度[24]。

此外，HSCCC還有應(yīng)用于成分的提取和敲除的相關(guān)報(bào)道，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)成分活性評價(jià)[25]。首先通過HSCCC-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用選取感興趣的化學(xué)信息，再采用HSCCC技術(shù)提取或敲除其余信息，最后對分離得到的化合物進(jìn)行生物活性檢測。如采用離線的中心切割HSCCC與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，線下借助1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)繪制出葡萄茶中具有抗氧化作用的成分輪廓圖，進(jìn)一步分離得到15個(gè)具有抗氧化活性的黃酮類成分[26]。此外，還利用此方法發(fā)現(xiàn)了高良姜中具有抗氧化活性的成分[27]，并聯(lián)合HSCCC制備液相色譜從忍冬葉中分離出具有抗氧化活性的黃酮苷和咖啡?？鼘幩醄28]。杜仲葉[29]和中華卷柏[30]中抗氧化成分的研究也采用了同樣的思路。在超高效液相色譜與多級質(zhì)譜聯(lián)用的基礎(chǔ)上，Zhao等[31]從芫花中分離得到具有抗艾滋病毒活性的瑞香烷二萜類成分。

與紫外檢測器不同，蒸發(fā)光散射等檢測器對成分具有破壞性，故以制備為目的HSCCC應(yīng)用多連接T型分流裝置或采用線下連接的方式逐一對樣品進(jìn)行檢測。由于抗氧化活性表征指標(biāo)較為成熟，且操作簡單、具有較強(qiáng)的可行性，因此活性檢測器多以抗氧化檢測為主。Gong等[32]對HSCCC技術(shù)在天然抗氧化劑的分離方面進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，HSCCC與抗氧化活性檢測器的聯(lián)合應(yīng)用有望對天然抗氧化劑的挖掘與評價(jià)做出重要貢獻(xiàn)。聯(lián)合活性試驗(yàn)的HSCCC技術(shù)也對新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和篩選具有重要意義。其他活性檢測方式如果能夠找到適宜的表征指標(biāo)，那么HSCCC在中藥及天然產(chǎn)物方面的研究將更有前景。

4 HSCCC與其他提取技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

中藥及天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，天然活性物質(zhì)研究面臨著分離效率低、活性成分流失的問題。近年來，有將新興提取技術(shù)與HSCCC聯(lián)用的相關(guān)報(bào)道，為提升活性成分的分離效率提供了參考。有學(xué)者采用CO2超臨界流體萃取法，首先將艾蒿中的茴蒿素分離，進(jìn)一步采用HSCCC技術(shù)從艾蒿中分離京尼平苷酸[33]。針對目標(biāo)成分的化學(xué)特性將提取分離方法有機(jī)地結(jié)合，通過響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，采用超聲波協(xié)助提取，并通過HSCCC技術(shù)對枸杞中的類胡蘿卜素成分進(jìn)行分離[34]。液液精萃與HSCCC聯(lián)合技術(shù)被提出，并且在蒲公英和蓍草的成分提取和分離中得到應(yīng)用[35]。Wang等[36]建立了水解提取-HSCCC法分離純化甘草中甘草素和甘草次酸的制備方法，甘草素和甘草次酸是甘草苷與甘草酸的水解產(chǎn)物，針對水解產(chǎn)物的分離和純化，將水解提取與HSCCC結(jié)合，大大擴(kuò)展了HSCCC的分離范圍。

5 近年HSCCC技術(shù)在分離中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分的應(yīng)用

分離與制備中藥和天然產(chǎn)物的生物活性成分，是進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和藥理藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)工作。HSCCC技術(shù)采用液液分配原理，避免了固體載體對成分的吸附和降解作用，被廣泛用于中藥及天然產(chǎn)物中黃酮、生物堿、木脂素、三萜和多酚類等化學(xué)成分的分離。對于黃酮苷類等較大極性成分，通常使用乙酸乙酯-水為基本組成的溶劑系統(tǒng)，如蓮、假澤蘭、葡萄籽中黃酮苷類成分的分離。生物堿類成分大多可以選用正己烷(石油醚)-乙酸乙酯-甲醇(乙醇)-水的溶劑體系。多數(shù)萜類成分極性較小，溶劑系統(tǒng)多采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、石油醚-乙醇-水，如乳香中乳香酸類成分、靈芝中靈芝酸的分離。針對多酚類成分，通常選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶劑系統(tǒng)，如分離夜來香籽和柿中的沒食子酸。而對于聚合度高、分子量較大、羥基個(gè)數(shù)較多的多酚類成分，則采用正丁醇-水為基礎(chǔ)構(gòu)成的溶劑體系，這類成分在紫外光下有較好的吸收，可采用紫外檢測器進(jìn)行檢測。

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系可以分離糖苷類、多酚類、苯丙素類以及羥基不飽和脂肪酸等成分。有學(xué)者采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)從夜來香籽(OenotherabiennisL)中分離出沒食子酸、原花青素B3、兒茶酸和沒食子酸甲酯，這些成分被認(rèn)為是有效的醛糖還原酶抑制劑，具有潛在的抑制糖尿病并發(fā)癥的作用[37]。Hu等[38]從闊葉十大功勞(Mahoniabealei(Fort.)Carr.)中分離出綠原酸、槲皮苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖，并發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化作用。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶12∶1∶12，v/v/v/v)可從白芍(RadixPaeoniaeAlba)中提取出1,2,3,4,6-五沒食子?；?β-D-葡萄糖，該單體可能通過MAPK和NF-κB途徑來減輕TNF-α介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞炎癥[39]。Sun等[40]開發(fā)了一種HSCCC策略與在線存儲(chǔ)回收洗脫技術(shù)相結(jié)合的方法，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶6∶6∶8，v/v/v/v)從苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中分離出山豆根紫檀綜苷、苦豆酮等成分。Cen等[41]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)從南五味子(KadsuralongipedunculataFinet et Gagnep)中分離出槲皮素-3-O-鼠李糖苷和原兒茶酸，該方法快速、有效，是從中藥中篩選和分離潛在活性化合物的良好方法。金錢草具有解毒消腫的功效，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5，v/v/v/v)可從金錢草(Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)中分離出異戊烯基化雙黃酮B和異戊烯基化雙黃酮C[42]。Feng等[43]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7∶12∶11∶5，v/v/v/v)從靈芝(Ganodermalucidum)中分離出靈芝酸S、靈芝酸T、靈芝醛B，它們是靈芝中主要的生物活性三萜。采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶4∶2∶6，v/v/v/v)可從胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)中大規(guī)模分離和純化大黃苷、丹葉大黃素[44]。黃花刺茄(Solanumrostratum)是一種對癌細(xì)胞具有毒性作用的植物，研究發(fā)現(xiàn)，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶7∶1∶7，v/v/v/v)可從其中分離出金絲桃苷、3’-O-甲基槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、紫云英苷、3′-O-甲基槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷等單體成分[45]。Shaheen等[18]采用己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6，v/v/v/v)和二氯甲烷-甲醇-水(4∶3∶2，v/v/v)兩步HSCCC法，對芒果花(Mangiferaindica.L)中沒食子酸、沒食子酸乙酯和鞣花酸進(jìn)行了分離和純化。Yan等[46]利用超臨界CO2流體萃取從小米椒(CapsicumfrutescensL. (Solanaceae))中提取辣椒素和二氫辣椒素，并進(jìn)一步采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.4∶0.6∶1.0∶1.0，v/v/v/v)對其進(jìn)行純化，結(jié)果表明，該方法高效、實(shí)用，可大規(guī)模地實(shí)現(xiàn)小米椒中辣椒素和二氫辣椒素的高效制備。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶5∶7，v/v/v/v)可從節(jié)鞭山姜(AlpiniaconchigeraGriff)中分離出6-姜辣素，該化合物在體外具有良好的抗氧化活性[47]。馬藺(IrislacteaPall. var. chinensis(Fisch.)Koidz)是一種鳶尾科植物，具有保肝、抗氧化、抗腫瘤的藥理活性，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶3∶6， v/v/v/v)[48]可從馬藺中提取出Vitisin D，白蘞素B和Vitisin A反式異構(gòu)體，這些單體可能具有潛在的藥效作用。馬桑根瘤菌(CoriarianepalensisWall,L.hammesii,L.plantarum)可以被正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1.5∶3∶2，v/v/v/v)提取出具有良好抑菌作用的羥基不飽和脂肪酸[49]。Liu等[50]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶2∶0.625，v/v/v/v)從永嘉早香柚(Citrus grandis(L.)Osbeck cv.)中分離出佛手柑素，該化合物首次被報(bào)道具有治療糖尿病的潛力。Wang等[51]采用2種不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶2∶5∶2、6∶1∶6∶1.2，v/v/v/v)，首次從杜仲(Eurycomalongifolia)中分離出longifolione A、longifolione B、longifolione C、longifolione D、longifolione E 5種化合物。此外，HSCCC還可用于霉菌中成分的分離。Sun等[52]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6.5∶3.5∶5∶5，v/v/v/v)從稻曲菌(Villosiclavavirens;UstilaginoideavirensTakahashi)中分離出稻曲菌素A、稻曲菌素G、稻曲菌素B、稻曲菌素H、稻曲菌素I、稻曲菌素C和稻曲菌素J，并對其結(jié)構(gòu)做了進(jìn)一步表征。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1%甲酸水(1∶5∶1∶5，v/v/v/v)可從紅曲霉(Monascus)中分離出黃單胞桿菌A和B[53]。2種不同比例的己烷類-乙酯-甲醇-水(6∶4∶5∶5、8.5∶1.5∶5∶5，v/v/v/v)，可從赤霉菌(Gibberella)中分離出桿孢菌素E、桿孢菌素E醋酸酯、疣孢菌素L醋酸酯、疣孢菌素J等成分，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究提供了借鑒[54]。

石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系可以分離酚類、酯類、酸類以及生物堿類成分。有學(xué)者采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.8∶1∶1∶0.8，v/v/v/v)從高良姜(AlpiniaofficinarumHance)中分離出純化高良姜素和山奈酚，兩者均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性[27]。Guo等[55]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶4∶7∶5，v/v/v/v)從厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. Et Wils.)中分離出和厚樸酚、厚樸酚、木蘭箭毒堿、木蘭花堿、毛蕊花糖苷等成分，為厚樸的質(zhì)量控制與臨床應(yīng)用研究提供了參考。除蟲菊(Chrysanthemum cineraraeflium)提取物被認(rèn)為是天然的殺蟲劑，除蟲菊酯是其主要有效成分，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶10∶2，v/v/v/v)是從除蟲菊中快速分離、純化除蟲菊酯的有效方法[56]。Cao等[57]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1∶6.5∶3.5，v/v/v/v)從木香(RadixAucklandiae)中分離出10α-甲氧基青蒿素酸、木香烯內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯，并進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶0.5∶5，v/v/v/v)可用于菝葜(SmilaxchinaL.)中5-O-咖啡酰莽草酸、紫杉葉、新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷成分的分離制備[58]。此外，不同體積比的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水還可用于牛蒡根(ArctiumlappaL.)中1,5-O-1,5-二咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩峒柞ズ?,5-O-二咖啡酰奎寧酸等10種成分的分離制備[59]。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.7∶1∶0.7，v/v/v/v)可實(shí)現(xiàn)爵床(Justicia procumbens L.)中爵床脂素A、爵床脂素B、6’-羥基爵床脂素C等10種成分的分離純化，且純度均在94%以上[60]。Li等[61]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，v/v/v/v)、 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶3∶7∶0.02、5∶5∶4.3∶5.7∶0.02，v/v/v/v/v)、乙酸乙酯-正丁醇-甲酸-水(4∶1∶0.5∶5，v/v/v/v)從臘梅花(Chimonanthuspraecox(Linn.)Link)中分離出3,4-二羥基苯甲酸、原兒茶醛、對香豆酸等8種化合物，并進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。刺五加(AcanthopanaxSessiliflorus(Rupr. & Maxim.)Seem)是五加屬最豐富的物種之一。研究者采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(3.5∶0.5∶1.5∶0.01，v/v/v/v)從刺五加中分離出矢車菊素3-木糖基半乳糖苷，并表明其具有顯著的抗氧化作用[62]。丹參(SalviaMiltiorrhizaBunge)是臨床常用的活血化瘀藥物，Yang等[63]采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(3∶1∶1∶20，v/v/v/v)從丹參中分離出蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-α-鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖和芹黃素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖，其中蘆丁和異槲皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化能力。氯仿-二氯甲烷-甲醇-水(4∶2∶3∶2，v/v/v/v)可從猴頭菇菌(Hericium erinaceum Mycelium)分離出染料木黃酮和黃豆苷元，表明HSCCC是從天然產(chǎn)物中高效分離和純化生物活性物質(zhì)的有力工具[64]。Wu等[65]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶3，v/v/v)從蓮(NelumbonuciferaGaertn.)中首次分離出槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷4種黃酮苷類成分，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)。Zhu等[66]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶5∶1，v/v/v)從南美番荔枝葉(AnnonasquamosaLinn)中分離出槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其中前三者在降血糖方面表現(xiàn)出良好的活性。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)是從可可樹(Theobromacacao)[67]中分離二聚原花青素B2的有效方法。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)和乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)可葡萄籽(VitisviniferaL.)[68]中分離出17種原花青素成分，且每種成分均具有較高的收率和純度，表明HSCCC是一種高效、快捷的成分分離方法。

此外，不同組成及配比的其他溶劑系統(tǒng)還可對中藥及天然產(chǎn)物進(jìn)行單體成分的分離。Wen等[69]采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，v/v/v/v)，從山楂葉(Crataeguspinnatifida)中分離出表兒茶素、金絲桃、異槲皮苷等7個(gè)成分，并進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)鑒定。Zhou等[70]采用乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水(9∶1∶0.5∶9，v/v/v/v)，從沙棘(HippophaerhamnoidesLinn)中分離出槐樟醇-7-O-{3-O-[2(E)-2,6-二甲基-6-羥基-2,7-辛二烯]}-α-L-鼠李糖苷和hippophanone 2種新化合物。Wang[71]等采用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)，從假澤蘭(Mikaniamicrantha)中分離出槲皮素-3-O-蕓香糖苷、木犀草苷、黃芩苷和黃芪素，結(jié)果表明磁納米顆粒-HSCCC在線分離系統(tǒng)高效、可回收，可用于從天然產(chǎn)物中極性相似黃酮類化合物的分離。Xu等[72]采用正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-水-不飽和脂肪酸(2∶2∶1∶5∶0.01，v/v/v/v)，從草莓(FragariaananassaDuch.)中分離出花葵素-3-O-葡萄糖苷，該成分可以用作天然生物活性劑，以防止細(xì)胞氧化應(yīng)激。研究報(bào)道，利用正己烷-乙醇-水等多種溶劑體系，從紅木樹皮(Ormocarpumkirkiibark)中分離出吡喃葡萄糖、柚皮素等14種極性不同的化合物，表明HSCCC分離成分無損失且溶劑用量少，是一種高效的天然產(chǎn)物分離方法[12]。Li等[73]采用氯仿-甲醇-水溶劑體系，從野菊花(DendranthemaindicumL.)中分離出金合歡素、芹菜素、木犀草素、蒙花苷等單體，進(jìn)一步明確了野菊花抗骨質(zhì)疏松作用的機(jī)制。醋乳香為乳香(Boswelliacarterii)經(jīng)醋炙后所得的中藥飲片，研究者采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)從醋乳香中分離出α-乳香酸等18種成分[14]。有學(xué)者[74, 75]采用己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)從葡萄(VitisviniferaL.)中分離出兒茶素、表兒茶素、肉豆蔻酸、咖啡酸和原花青素等多種化合物，表明HSCCC與制備型HPLC聯(lián)用方便、高效，是分離葡萄中多酚類成分的有效策略。Kucab等[76]采用叔丁基甲基醚-丁醇-乙腈-水和等溶劑體系，從雞冠花(CelosiacristataL.)中分離出甜菜紅素，并對其中的β-花青素進(jìn)行了首次測定。Liu等[77]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)和正丁醇-水-甲醇-乙酸乙酯(1∶6∶0.5∶4，v/v/v/v)從秀山金銀花(Loniceramacranthoides)中分離出木通皂苷D等4種皂苷類成分，且這些成分均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(5∶6∶5∶5，v/v/v/v)是絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)中商陸苷有效的分離純化方法[78]。Marques等[79]采用正己醇-乙腈(1∶1，v/v)和正己烷-乙腈-乙酸乙酯(1∶1∶0.4，v/v/v)，從胡椒(Piperclaussenianum(Miq.)C.DC.(Piperaceae))中分離出橙花叔醇、芳樟醇等成分，表明HSCCC技術(shù)對于分離萜烯物質(zhì)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。Chen等[80]采用乙酸乙酯-丁醇-水(2∶1∶3，v/v/v)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v/v/v)，從龍膽(GentianascabraBunge)中分離出番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和三葉苷4種化合物，這些化合物均具有良好的抑制一氧化氮分泌作用。Cho等[81]采用乙酸乙酯-乙腈-水(1∶0.1∶1，v/v/v)，從白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)中分離出aceroside VIII和platyphylloside，并對癌細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性抑制作用，可能是癌癥的靶向治療劑。Geng等[82]采用丁醇-乙酸-水(4∶1∶5，v/v/v)從甘蔗(SaccharumsinensisRoxb.)中分離出對香豆酸、阿魏酸等單體，提高了天然產(chǎn)物的綜合利用價(jià)值。此外，利用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)可從大葉藤黃(Garciniaxanthochymus)中分離出大葉藤黃醇和guttiferone E，實(shí)現(xiàn)了異構(gòu)體的良好分離[83]。Lu等[84]采用正己烷-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)從長果婆婆納(VeronicaciliataFisch.)中分離出木犀草素、4-羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸等5種化合物，并研究表明其均具有良好的抗肝癌活性。Du等[85]采用正己醇-丙酮-乙醇-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)首次從紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)中分離出蝦青素，并對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。乙酸乙酯-丁醇-1.5% 水合氫氧化銨(1∶4∶5，v/v/v)可從冬蟲夏草(Cordycepsmilitaris)[86]中分離出3種核苷，且其純度均在98%以上。

通過對HSCCC在中藥及天然產(chǎn)物物質(zhì)基礎(chǔ)研究應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析，為中藥及天然產(chǎn)物物質(zhì)基礎(chǔ)的溶解系統(tǒng)選擇和溶劑比例等方面提供了借鑒。HSCCC具有分離結(jié)果純凈、制備量較大、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于高純度活性物質(zhì)對照品的制備。

6 小結(jié)

中醫(yī)復(fù)方是中藥在臨床應(yīng)用中的基本形式，開展中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究對于推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程至關(guān)重要。中藥及天然產(chǎn)物的活性成分是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來源[87]。隨著復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的推進(jìn)，中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)雖未完全闡明，但在不同層面上都取得了一定進(jìn)展。如若實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的突破，更需思想與方法的多元化。HSCCC技術(shù)不僅可以分離得到單體成分，還可以實(shí)現(xiàn)全成分分段分離，發(fā)現(xiàn)活性部位甚至活性成分，這在一定程度上克服了中醫(yī)復(fù)方研究中藥效成分種類眾多、含量懸殊帶來的挑戰(zhàn)。近些年，基于溶劑體系、洗脫方式、檢測技術(shù)以及與其他分離技術(shù)聯(lián)用的創(chuàng)新研究，極大地推動(dòng)了HSCCC技術(shù)的應(yīng)用，具有十分重要的意義。

雖然HSCCC技術(shù)不斷進(jìn)步，但其廣泛應(yīng)用仍然受到制約。盡管有學(xué)者建立了經(jīng)驗(yàn)性的溶劑體系篩選方法[87]，但在實(shí)際應(yīng)用中受到操作者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的影響。目前HSCCC技術(shù)雖已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了上百毫克級乃至數(shù)十克級成分的分離制備，但對于數(shù)百克級甚或公斤數(shù)量級的制備能力還有待提高。相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，HSCCC技術(shù)將為中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供更加完備的技術(shù)支撐。