美洲大蠊乙醇提取物對香煙引起小鼠肺臟氧化應(yīng)激的干預(yù)效果研究

王 欽，伏 蓉，隋世燕，王惠玲，楊溢萍，蔣淋源，段 雷

(大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000)

吸煙已成為繼高血壓之后的全球第二號健康殺手，是導(dǎo)致心腦血管疾病、慢性阻塞性肺病和癌癥等多種疾病的重要的危害因素，是引起肺癌最重要的危險(xiǎn)因子(曹超，2012)?！吨袊鼰熚：】祱?bào)告》曾指出，吸煙者的平均壽命會比不吸煙者減少10年。有研究發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)吸煙者暴露在致癌物質(zhì)中的風(fēng)險(xiǎn)比直接吸煙者高2.5倍(Andersonetal., 2012)。吸煙與機(jī)體氧化應(yīng)激存在高相關(guān)性，能夠誘導(dǎo)生命體抗氧化能力下降(曹超, 2012)。

自由基是生物體內(nèi)涉及電子傳遞生化過程中的一種正常的代謝產(chǎn)物，是機(jī)體防御系統(tǒng)的組成部分，但是如果體內(nèi)自由基產(chǎn)生的過多或者清除的過慢，多余的自由基會通過攻擊細(xì)胞中的生命大分子物質(zhì)，造成機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)疾病(張成桂等, 2010)。機(jī)體有兩套防御系統(tǒng)來對抗氧化應(yīng)激(Wathesetal., 2007)，其中抗氧化酶類，即機(jī)體內(nèi)部的酶類抗氧化系統(tǒng)，屬于一級防御系統(tǒng)，可以直接清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧或抑制其氧化。包括過氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)等，常見的機(jī)體氧化應(yīng)激標(biāo)志物有丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)，它們能夠反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度(Bagchietal., 1997)。

美洲大蠊Periplanetaamericana,俗稱蟑螂、小強(qiáng)，食性比較廣泛，能夠傳播病菌，其糞便和分泌物中還含有致癌物質(zhì)，屬世界性害蟲，但其體內(nèi)具有抗腫瘤、促進(jìn)血管增生和組織修復(fù)、抗菌、抗肝炎等活性物質(zhì)(張成桂等，2010)。美洲大蠊乙醇提取物能夠降低肝臟組織的MDA水平和提高SOD、GSH-Px的水平，提示美洲大蠊提取物能夠抑制肝臟組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用(隋世燕等，2017)。在力竭運(yùn)動(dòng)過程中，美洲大蠊提取物可以提高抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性，降低MDA的含量，同時(shí)又可刺激血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激相關(guān)基因eNOS的表達(dá)，降低心肌組織中脂質(zhì)過氧化的水平，延長了大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的目的(馬俊等, 2015)；還能使大鼠血中MDA和NO含量顯著減少(隋世燕等, 2017)。說明美洲大蠊乙醇提取物具有顯著的抗氧化功能，但是，其在吸煙引起的小鼠肺氧化應(yīng)激中是否有緩解效果還不清楚。

本研究將建立小鼠被動(dòng)吸煙模型，然后給予不同濃度的美洲大蠊醇提物，分別檢測小鼠血漿和肺臟中NO、MDA的含量以及SOD、CAT、GSH-Px的活力，并檢測相關(guān)基因表達(dá)的水平，結(jié)合肺臟病理切片，探討美洲大蠊醇提物對被動(dòng)吸煙引起小鼠肺氧化應(yīng)激的干預(yù)效果，為美洲大蠊乙醇提取物在這方面的生產(chǎn)應(yīng)用和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇性成熟雌性KM小鼠28只，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自第三軍醫(yī)大學(xué)，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2007-017，使用許可證號：SCXX(滇)2005-0010。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為4組，每組7只；由于試驗(yàn)期間灌胃操作不當(dāng)死亡4只，采樣時(shí)對照組6只、熏煙組5只、低劑量組7只、高劑量組6只。

1.1.2美洲大蠊醇提物的制取

美洲大蠊成蟲處死后，晾干、粉碎，用15倍質(zhì)量的95%乙醇進(jìn)行冷浸提取3次，蒸發(fā)濃縮后的浸膏放入-40℃冰柜保存?zhèn)溆?隋世燕等, 2017)。

1.1.3香煙選擇

選取云煙品牌中的“云煙(紫)”作為本實(shí)驗(yàn)用煙，煙長84 mm，軟包裝，每包20只，含焦油13 mg，尼古丁1.2 mg。

1.1.4實(shí)驗(yàn)處理

對照組處于正常環(huán)境飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)開始后每天灌胃與實(shí)驗(yàn)組等比例的生理鹽水，其余3組每天置于靜式染毒柜內(nèi)進(jìn)行香煙暴露，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)(童寅等, 2015)，每天2次煙熏(12 ∶00和18 ∶00)，第1天每次2支，每隔3 d增加1次煙量(每次增加2支)，最高增加至每次8支不再增加。從煙熏開始至結(jié)束共計(jì)33 d，其中第8天、第15天不進(jìn)行煙熏。具體方法：同時(shí)點(diǎn)燃單次用煙，燃煙開始時(shí)將小電風(fēng)扇放置于距染毒柜一定距離，對準(zhǔn)染毒柜底部小孔吹風(fēng)至煙燃完(保證一定量的空氣進(jìn)入，防止煙熄或者小鼠窒息)，關(guān)閉風(fēng)扇，再熏10 min。本研究所用靜式染毒柜為桶狀、半封閉的透明染毒柜，底部有一圓形小口(即毒物入口)，上方蓋子有一煙囪狀氣體出口。

從煙熏處理開始的第17天晚上21 ∶30開始對小鼠進(jìn)行灌胃直至煙熏結(jié)束，灌胃共計(jì)16 d(中間1 d不進(jìn)行灌胃)。灌胃劑量參考隋世燕等(隋世燕等, 2017)和甘平等(甘平等, 2011)文獻(xiàn)，熏煙組使用生理鹽水灌胃(10 mL/kg體重)；低劑量組灌胃美洲大螊醇提物(10 mL/kg體重，0.09 g/mL)；高劑量組灌胃美洲大螊醇提物(10 mL/kg體重，0.27 g/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集全血和肺臟。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均自由采食、飲水，保持室溫。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑

SOD、GSH-Px、CAT、MDA和NO檢測試劑盒，均購自南京建成；Trizol購自Life Technologies；含SYBR GREEN的DNA聚合酶、DNA酶，購自Takara；反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega；RNA酶抑制劑和dNTP，購自南京生興。引物由蘇州金唯智合成。

1.2.2主要儀器

可見分光光度計(jì)；NanoDrop分光光度計(jì)(ND-1000)；普通PCR儀；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；熒光顯微鏡(BX41)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣本采集

實(shí)驗(yàn)開始36 d后采樣，稱量體重后摘眼球法取血，注入含肝素鈉的2 mL EP管；采集肺臟稱重，每個(gè)肺臟剪取相同部位的部分肺組織放入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，剩余肺臟放入EP管中，置-80℃冰箱保存。血液4 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集上清。肺臟病理切片由大理州人民醫(yī)院病理科制作。肺臟系數(shù)即肺臟體重比，是肺臟與體重質(zhì)量的比值。

1.3.2血漿中各氧化和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

相關(guān)指標(biāo)的測定按照商品說明書進(jìn)行操作。

1.3.3基因表達(dá)測定

1.3.3.1 RNA提取及質(zhì)量控制

使用Trizol提取肺臟組織總RNA，然后使用NanoDrop測定其濃度，如果超過2 000 ng/μL則稀釋后重測，使OD260/280在2.0左右。最后取6 μg RNA，使用雙蒸水稀釋到500 ng/μL，每管吸取4 μL，各吸2管，用于RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3.2 反轉(zhuǎn)錄

使用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體積為25 μL。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置4℃冰箱備用。

1.3.3.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上小鼠的相關(guān)cDNA序列，使用CNKI網(wǎng)站中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)目的和內(nèi)參β-Actin基因的引物，最后由蘇州金唯智合成(表1)。

表1 基因表達(dá)引物序列

1.3.3.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

將cDNA原液稀釋10倍，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測目的基因的表達(dá)，使用20 μL體系。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，64℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)。統(tǒng)計(jì)方法使用2-ΔΔCt法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS 17.0中的One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟系數(shù)和血液中各指標(biāo)的影響

2.1.1對血漿中SOD和CAT活力及肺臟系數(shù)的影響

4個(gè)組對小鼠血漿中總SOD和CAT活力以及小鼠肺臟系數(shù)的影響相互之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2對血漿中NO、MDA含量和GSH-PX活力的影響

低劑量和高劑量美洲大蠊組與對照組相比，對血漿中NO和MDA的含量(圖1-A和圖1-B)以及GSH-PX的活力(圖1-C)的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，與對照組相比，熏煙組顯著升高了血漿中NO的含量(P=0.027)，顯著降低了血漿中GSH-PX的活力(P=0.028)；與熏煙組相比，低劑量組(P=0.041和P=0.025)和高劑量組(P=0.029和P=0.028)均顯著降低

圖1 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠血漿中NO、MDA和GSH-PX水平的影響Fig.1 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of NO、MDA and GSH-PX in plasma of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，兩組之間比較差異顯著。Notes: “*” meant P<0.05, differed significantly between two groups.

了血漿中NO和MDA的含量；而高劑量組則顯著升高了血漿中GSH-PX的活力(P=0.029)，分析結(jié)果見圖1。

2.2 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟中各指標(biāo)的影響

2.2.1對肺臟中SOD及CAT活力的影響

4個(gè)組對小鼠肺臟中總SOD和CAT活力的影響相互之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.2對肺臟中NO、MDA含量和GSH-PX活力的影響

低劑量和高劑量美洲大蠊組與對照組相比，對肺臟中NO和MDA的含量(圖2-A和圖2-B)以及GSH-PX的活力(圖2-C)的影響均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，與對照組相比，熏煙組顯著升高了肺臟中NO(P=0.036)和MDA(P=0.026)的含量。與熏煙組相比，低劑量組(P=0.040和P=0.046)和高劑量組(P=0.037和P=0.013)均顯著降低了肺臟中NO和MDA的含量；并且低劑量組(P=0.040)和高劑量組(P=0.036)均顯著升高了肺臟中GSH-PX的活力，分析結(jié)果見圖2。

圖2 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟中NO、MDA和GSH-PX水平的影響Fig.2 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of NO、MDA and GSH-PX in lung of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，兩組之間比較差異顯著。Notes: “*” meant P<0.05, differed significantly between two groups.

2.3 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組小鼠肺泡大小、分布基本均勻、結(jié)構(gòu)完整(圖3-A)，氣道壁結(jié)構(gòu)清晰、上皮完整，纖毛尚存(圖4-A)。熏煙組肺泡分布較為凌亂，肺泡隔變厚、有斷裂，肺泡腔融合變大，有滲血現(xiàn)象(圖3-B)。與熏煙組相比，低劑量組肺泡分布有改善，肺泡隔斷裂較少，但較正常對照組肺泡腔融合擴(kuò)大現(xiàn)象較嚴(yán)重，肺泡隔增厚(圖3-C)；而高劑量組小鼠肺泡組織、結(jié)構(gòu)明顯改善，滲血減少，接近正常對照組，但仍有肺泡腔融合現(xiàn)象(圖3-D)。

圖3 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟病理的影響(10×)Fig.3 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on lung pathology of mice by cigarette smoke (10×)注：A，對照組；B，熏煙組；C，低劑量組；D，高劑量組。Notes: A, Control group; B, Smoking group; C, Low-dose group; D, High-dose group.

熏煙組小鼠肺小氣道上皮細(xì)胞排列不整齊，受損明顯，纖毛脫落、丟失(圖4-B)，而低劑量組(圖4-C)和高劑量組(圖4-D)均有改善?？梢姡蛣┝亢透邉┝康拿乐薮篌勾继嵛飳ο銦熢斐傻姆谓M織損害有緩解作用，高劑量組效果更好。

圖4 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟病理的影響(40×)Fig.4 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on lung pathology of mice by cigarette smoke (40×)注：圖中箭頭所指即小氣道上皮。A，對照組；B，熏煙組；C，低劑量組；D，高劑量組。Notes: The arrow in the picture refered to the small airway epithelium. A, Control group; B, Smoking group; C, Low-dose group; D, High-dose group.

2.4 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟中抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1對SOD和CAT基因表達(dá)的影響

4個(gè)組對小鼠肺臟中SOD和CAT基因表達(dá)的影響相互之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4.2對GSH-PX基因表達(dá)的影響

低劑量和高劑量美洲大蠊組與對照組相比，對肺臟中GSH-PX基因的表達(dá)的影響均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，與對照組相比，熏煙組極顯著降低了小鼠肺臟中GSH-PX基因的表達(dá)(P<0.01)；與熏煙組相比，低劑量和高劑量的美洲大蠊乙醇提取物均顯著上調(diào)了小鼠肺臟GSH-PX基因的表達(dá)水平(P<0.05)，分析結(jié)果見圖5。

圖5 美洲大蠊醇提物對熏煙小鼠肺臟GSH-PX基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Periplaneta americana ethanol extract on the level of GSH-PX mRNA expression in lung of mice by cigarette smoke注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，兩組之間比較差異顯著。Notes: “*” meant P<0.05, “**” meant P<0.01, differed significantly between two groups.

3 結(jié)論與討論

美洲大蠊中具有顯著的抗腫瘤、促進(jìn)血管增生和組織修復(fù)、抗菌、抗肝炎等活性物質(zhì)，目前，很多科學(xué)家和科研單位正致力于美洲大蠊抗腫瘤、結(jié)腸癌、肝纖維化等有效活性成分的研究上，針對其抗氧化應(yīng)激的作用效果主要停留在體外研究上，而本文是在體研究美洲大蠊乙醇提取物抗氧化應(yīng)激的效果，并且結(jié)合社會難題研究該提取物對香煙引起的肺臟氧化應(yīng)激的干預(yù)效果，從選題上具有創(chuàng)新性，也具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

機(jī)體內(nèi)過多的氧自由基可以引起生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，引起細(xì)胞毒性(Oyawoyeetal., 2003)；GSH-PX是機(jī)體內(nèi)重要的分解過氧化物的抗氧化酶，能夠與SOD和CAT一起將體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2和O2-轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的H2O分子(Husainetal., 2001)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的美洲大蠊醇提物能夠顯著降低熏煙小鼠血中氧化應(yīng)激指標(biāo)NO及MDA的含量，并且能夠增加熏煙小鼠血和肺臟中GSH-PX的活力以及它在肺臟中的基因表達(dá)水平。這與鄒俊波等(鄒俊波等, 2016)研究美洲大蠊醇提物通過抗氧化作用預(yù)防小鼠急性胃潰瘍的結(jié)果相類似。

煙霧刺激可以誘導(dǎo)活化嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞，又可以釋放大量的氧化產(chǎn)物和氧自由基，進(jìn)一步促進(jìn)肺組織的破壞(Oyawoyeetal., 2003)。王冬雪等(王冬雪等, 2019)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HE染色，吸煙組小鼠肺泡大小不一，結(jié)構(gòu)不清晰，肺泡壁增厚，有斷裂，肺泡腔融合變大；隨煙量的增加，肺組織病理變化愈嚴(yán)重。而本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊醇提物能夠有效緩解香煙對肺組織造成的上述損害。可見，美洲大蠊乙醇提取物對熏煙小鼠的機(jī)體具有顯著的抗氧化應(yīng)激功能，但是，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

美洲大蠊提取物如何通過消化系統(tǒng)進(jìn)而影響肺臟機(jī)能未見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物能夠通過PI3K/AKT信號通路增加肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡；也可以通過阻斷MAPK信號通路中JNK、p38、ERK1/2蛋白的表達(dá)抑制肝臟星狀細(xì)胞HSC-T6的增殖，有效保護(hù)肝硬化(范懷艷, 2015)，還可以通過阻斷PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)來抵抗肝纖維化(張成桂等, 2010)。但是，美洲大蠊乙醇提取物對熏煙小鼠的肺臟抗氧化應(yīng)激功能是否通過MAPK或PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用還不清楚。我們將在本研究的基礎(chǔ)上，就美洲大蠊乙醇提取物的具體活性成分及其分子作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。