摩腹手法對原發(fā)性失眠大鼠行為學(xué)狀態(tài)的影響

高建輝，張超凡，崔小鋒，余云飛，王 程

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830001）

失眠現(xiàn)已成為社會普遍存在的、嚴(yán)重影響公眾身心健康和生活質(zhì)量的健康問題，長期失眠不僅會增加多種疾病的患病風(fēng)險，同時還會影響焦慮、抑郁等情緒狀態(tài)和精神疾病的發(fā)生[1]。近年來，越來越多的行為學(xué)測試被應(yīng)用于動物實驗中，通過觀察動物焦慮、抑郁等行為學(xué)狀態(tài)的變化，可對模型質(zhì)量和干預(yù)療效進行評價[2]。中醫(yī)推拿療法中的摩腹手法現(xiàn)已被應(yīng)用于原發(fā)性失眠的臨床治療中，具有療效確切、易于患者接受等優(yōu)勢。本研究通過觀察摩腹手法對原發(fā)性失眠模型大鼠行為學(xué)狀態(tài)以及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響，探討摩腹手法調(diào)節(jié)大鼠焦慮和抑郁狀態(tài)的機制，希望能為失眠的推拿治療提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

64 只SPF 級Wistar 大鼠，雌雄各半（新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），體質(zhì)量（250±50）g，在新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF 級屏障系統(tǒng)環(huán)境下喂養(yǎng)，光照12 h，安靜通風(fēng)，溫控18～22 ℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用分層隨機分組法分為：空白組、模型組、摩腹組和拮抗組各16 只，每組雌雄各半。5-HT 檢測試劑盒（H104）、DA 檢測試劑盒（H170）、NE 檢測試劑盒（H096）、ACH 檢測試劑盒（A105）（南京建成生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（上海信帆生物科技有限公司），食欲素受體拮抗劑MK-4305（MB3773，大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗造模 針對模型組、摩腹組和拮抗組的大鼠進行原發(fā)性失眠造模。采用自制改良平臺水環(huán)境法：準(zhǔn)備桶口直徑約30 cm、高約40 cm 的塑料圓筒作為鼠箱，其內(nèi)底部固定1 個直徑約6 cm、高約10 cm 的圓柱體平臺；桶內(nèi)注水并使水面保持在平臺面下方約1 cm 處，水溫保持約20 ℃；將造模大鼠放于平臺上，每桶1 只。準(zhǔn)備直徑約25 cm、網(wǎng)格邊長約1 cm 的圓形鐵絲網(wǎng)，用細(xì)鐵絲橫穿鐵絲網(wǎng)面并使其兩端扣住桶口，可將鐵絲網(wǎng)水平固定在桶內(nèi)，保持鐵絲網(wǎng)高度在平臺上方約15 cm；鐵絲網(wǎng)上放置飲水和食物。每日更換桶內(nèi)清水并進行清潔消毒，持續(xù)8 d。

模型評價：造模結(jié)束后，4 組大鼠均進行戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗[3]。根據(jù)預(yù)實驗測出確保所有大鼠發(fā)生睡眠的最小閾劑量，給予大鼠戊巴比妥鈉溶液腹腔注射，記錄大鼠的睡眠潛伏時間和睡眠時間。翻正反射消失1 min 起判定開始睡眠，翻正反射恢復(fù)判定睡眠結(jié)束。統(tǒng)計分析4 組大鼠的睡眠潛伏時間和睡眠時間，P＜0.05 則判定造模成功。

2.2 干預(yù)方法 摩腹組：操作者左手將大鼠束縛，左手五指可將大鼠四肢固定伸展開，并使其保持仰臥位，右手進行摩腹手法操作：操作者右手中指末節(jié)指腹羅紋面著實于大鼠腹部關(guān)元，余四指自然平伸，通過肩關(guān)節(jié)在外前方向的小幅度環(huán)轉(zhuǎn)，帶動中指在大鼠腹部做逆時針方向環(huán)形平移摩擦；移動路線為鳩尾、關(guān)元和雙側(cè)帶脈穴形成的閉合圓環(huán)；頻率每分鐘5～7 圈，持續(xù)5 min 后，以同樣方法順時針再操作5 min。手法要求平穩(wěn)著實，每日1 次，連續(xù)14 d。拮抗組：食欲素受體拮抗劑（10 mg/kg）溶液每日灌胃[4]，2 h 后給予摩腹手法，操作同摩腹組。模型組和空白組：每日于固定架束縛10 min，每日1 次，持續(xù)14 d。

2.3 行為學(xué)實驗 干預(yù)結(jié)束后4 組大鼠進行行為學(xué)測試。

2.3.1 曠場試驗 曠場箱為底面邊長100 cm、高40 cm的黑色立方形箱體，底面由灰線均分成25 個正方形小格，外層的16 個方格為外周區(qū)，中央的9 個方格為中央?yún)^(qū)。從大鼠被放入正中央的方格內(nèi)時開始計時，通過配套圖像采集設(shè)備和軟件進行行為學(xué)數(shù)據(jù)收集，觀察3 min 內(nèi)大鼠在曠場箱內(nèi)的運動總距離、站立次數(shù)及在中央?yún)^(qū)停留時間。每次測試結(jié)束后清理糞便，并用75%乙醇清潔箱底面和內(nèi)側(cè)壁后，再進行下一只測試。

2.3.2 高架十字迷宮試驗 迷宮為通體呈深灰色的十字形結(jié)構(gòu)，由兩條開放臂和兩條閉合臂（開、閉臂長45 cm、寬15 cm、高30 cm）以及一個連接它們的中央平臺（邊長15 cm）組成，迷宮距地面高度60 cm。試驗開始前預(yù)先讓大鼠頭朝向一側(cè)閉合臂，從其被放上中央平臺時開始計時，記錄5 min 內(nèi)大鼠的行為學(xué)指標(biāo)：開放臂進入次數(shù)（OE）、開放臂進入次數(shù)百分比（OE%）、開放臂停留時間（OT）、開放臂停留時間百分比（OT%）和中央平臺停留時間（CT）。每次測試結(jié)束后清理糞便，并用75%乙醇擦拭迷宮內(nèi)側(cè)壁及底面。

2.4 取材及標(biāo)本處理 4 組大鼠麻醉完全后依次斷頭取腦，分離出腦干組織，將其稱取質(zhì)量后勻漿、離心，取上清。

2.5 檢測指標(biāo) 運用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）測定腦干樣品內(nèi)5-HT、NE、DA 和ACH 的水平，根據(jù)各自試劑盒的說明進行檢測。記錄各組樣品的OD 值，運用配套軟件繪制出標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計算相應(yīng)濃度水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進行描述，完成正態(tài)性和方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；不滿足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 造模情況 見表1。

造模結(jié)束后4 組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗結(jié)果見表1，與空白組相比，造模的3 組大鼠睡眠潛伏時間和睡眠時間與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），判定模型復(fù)制成功。

表1 造模后各組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗比較（）

表1 造模后各組大鼠戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗比較（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05

3.2 大鼠的一般情況 造模結(jié)束后，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，目光有神，毛發(fā)光亮順滑色白，被抓取時警惕性和反抗較弱。造模的3 組大鼠自造模第3 天起，陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡，毛發(fā)凌亂，部分發(fā)黃開叉，被抓取時警惕性和掙扎力量變?nèi)?；造模? 天起陸續(xù)表現(xiàn)出對外界反應(yīng)的敏感，被抓取時出現(xiàn)攻擊行為和易激惹狀態(tài)，小部分則出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，掙扎力量下降的情況；造模結(jié)束時，大部分大鼠表現(xiàn)出強烈的攻擊行為和易激惹狀態(tài)，精神高度緊張，稍有聲響即相互撕咬或呈雙前肢互相抵制的兩兩對峙狀態(tài)，目光焦灼，毛發(fā)雜亂、暗黃無光且部分變硬豎起，被抓取時表現(xiàn)出強烈的警惕性和進攻撕咬行為；剩余個別大鼠出現(xiàn)了精神萎靡，四肢無力，明顯消瘦的情況；干預(yù)結(jié)束后，3 組大鼠精神狀態(tài)均明顯好轉(zhuǎn)，毛發(fā)顏色基本恢復(fù)，其中摩腹組大鼠警惕性、易激惹以及被抓取時攻擊性的下降最為明顯，模型組次之，拮抗組仍有小部分大鼠未徹底緩解；此外，相互撕咬的情況在干預(yù)3 d后完全消失，僅模型組大鼠可偶見有瞇眼和片刻的小打鬧。

3.3 大鼠曠場實驗情況 見表2。

表2 各組大鼠曠場試驗結(jié)果（）

表2 各組大鼠曠場試驗結(jié)果（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

3.4 大鼠高架十字迷宮試驗情況 見表3。

表3 各組大鼠高架十字迷宮試驗結(jié)果（）

表3 各組大鼠高架十字迷宮試驗結(jié)果（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

3.5 大鼠腦干內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平 見表4。

表4 各組大鼠腦干內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平（）

表4 各組大鼠腦干內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

4 討論

本實驗在改良多平臺水環(huán)境法[5]造模的基礎(chǔ)上進行了部分改進。首先，采用塑料圓筒作為鼠箱，一桶一只，可完全避免造模過程中大鼠為創(chuàng)造睡眠環(huán)境而相互踩踏下水致死的情況；其次，鐵絲網(wǎng)高度可調(diào)，大鼠在平臺上起身站立即可用雙前肢扒住鐵絲網(wǎng)，通過網(wǎng)格空隙進食飲水，不會影響日常飼養(yǎng)；第三，造模所需所有材料都可直接購買獲得，鼠箱的制作簡單易行；第四，每日更換桶內(nèi)清水并進行清潔消毒，可避免因代謝物滯留產(chǎn)生的問題。

曠場試驗是研究動物自發(fā)活動與探索行為的試驗[6]，可對大鼠的焦慮、抑郁狀態(tài)及適應(yīng)環(huán)境能力等進行評價[7-8]。運動總路程反映大鼠對新環(huán)境的適應(yīng)程度，二者呈正相關(guān)；中央?yún)^(qū)停留時間反映大鼠的焦慮水平，二者呈負(fù)相關(guān)[9]；站立次數(shù)反映大鼠在陌生環(huán)境中的活躍度、興奮性以及抑郁程度，其與活躍度和興奮性呈正相關(guān)，與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)[10-11]。本實驗中，與空白組相比，模型組大鼠在運動總路程和站立次數(shù)上均有明顯減少（P＜0.05），而在中央?yún)^(qū)停留時間上無顯著差異（P＞0.05），提示與空白組相比，模型組大鼠對新環(huán)境的適應(yīng)力、活躍度和興奮性均明顯降低，而抑郁程度有明顯增加，焦慮水平則無明顯差異。與模型組相比，摩腹組和拮抗組大鼠在運動總路程和站立次數(shù)上均有明顯增加（P＜0.05），而在中央?yún)^(qū)停留時間上無顯著差異（P＞0.05），提示與模型組相比，摩腹組和拮抗組大鼠對新環(huán)境的適應(yīng)力、活躍度和興奮性均明顯回升，抑郁程度明顯回落，而焦慮水平無明顯變化。

高架十字迷宮試驗是能確切評估大鼠焦慮狀態(tài)的穩(wěn)定方法[12]。主要利用動物對新異環(huán)境的探究特性，和對高懸開放臂的恐懼形成矛盾沖突的心理而產(chǎn)生焦慮狀態(tài)[13]，通過分析OE、OE%、OT 和OT%可反映大鼠的焦慮水平[14-15]。其中，OE%和OT%是關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)，與大鼠焦慮水平成反比[16]。本實驗中，與空白組相比，模型組大鼠的OE 和OE%均有明顯減少（P＜0.05），而OT 和OT%差異不明顯（P＞0.05）。提示：與空白組相比，模型組大鼠可能產(chǎn)生了一定的焦慮狀態(tài)。與模型組相比，摩腹組和拮抗組大鼠在OE、OE%、OT 和OT%上均有明顯增加（P＜0.05），提示：與模型組相比，摩腹組和拮抗組大鼠的焦慮水平有了明顯下降。

人體睡眠和覺醒的產(chǎn)生與維持主要受到腦內(nèi)的睡眠和覺醒中樞的調(diào)控[17]。其中，藍(lán)斑NE 能、中縫背核5-HT 能、黑質(zhì)DA 能和基底前腦ACH 能等單胺能神經(jīng)元，是腦內(nèi)覺醒調(diào)節(jié)中樞的主要結(jié)構(gòu)，其纖維末梢釋放相應(yīng)的覺醒遞質(zhì)，可直接興奮對應(yīng)腦區(qū)的活動[18-19]，從而維持覺醒狀態(tài)?？梢?，以上神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化，在中樞對睡眠和覺醒狀態(tài)的調(diào)節(jié)中起到了重要作用。上述結(jié)論在本實驗中均得到體現(xiàn)：與空白組相比，模型組大鼠腦干內(nèi)的DA、NE、5-HT 和ACH的水平均產(chǎn)生了顯著變化（P＜0.05）；并且，除了ACH 水平外，摩腹組和拮抗組大鼠腦干內(nèi)的DA、NE和5-HT的水平與模型組相比也都呈現(xiàn)出顯著差異（P＜ 0.05）。據(jù)此推測：摩腹手法可能對覺醒中樞內(nèi)DA、NE 和5-HT 這3 種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響比較明顯，從而降低了覺醒中樞對大腦皮質(zhì)的興奮作用。此外，腦內(nèi)單胺能神經(jīng)元還參與了中樞對情緒的調(diào)節(jié)，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度的異常與焦慮癥和抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[20-25]。這在本實驗中也有相應(yīng)體現(xiàn)：4 組大鼠之間腦干內(nèi)DA、NE、5-HT 和ACH 水平的差異，與它們在曠場試驗和高架十字迷宮試驗中反映出的焦慮和抑郁狀態(tài)的差異都相互對應(yīng)。這也從一定程度上證明了本實驗結(jié)果的可靠性，提示：摩腹手法可通過調(diào)節(jié)中樞DA、NE、5-HT 和ACH 的水平，對原發(fā)性失眠大鼠的焦慮和抑郁狀態(tài)起到一定的緩解作用。

最后，本實驗作為一個子課題，根據(jù)總課題的研究目的而設(shè)立了拮抗組，可為最終的研究結(jié)論提供一定的行為學(xué)依據(jù)。