注射用黃芩苷鎂鹽凍干粉配伍穩(wěn)定性及其保肝作用研究

白紅紅，金 鵬，李 景，李 衛(wèi)，劉喜綱，劉翠哲*

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000；2.晨光生物科技集團(tuán)邯鄲有限公司，河北 邯鄲 056000）

黃芩苷（結(jié)構(gòu)式見圖1）屬黃酮類化合物，是黃芩的主要成分之一。黃芩苷作為提取物被收錄于2015 年版《中國藥典》，是黃芩通過水提酸沉制備得到，純度不低于85%，但得到的黃芩苷幾乎不溶于水，口服生物利用度低，大鼠口服給藥后僅為（2.2±0.2）%，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用［1-2]。

圖1 黃芩苷結(jié)構(gòu)式

為提高黃芩苷的溶解度，國內(nèi)外研究人員采用納米晶藥物輸送系統(tǒng)［3-4]、靶向脂質(zhì)體等技術(shù)［5]，但程度有限。課題組前期研究證明，黃芩苷在黃芩中的原本存在形式是鎂鹽形式（結(jié)構(gòu)式見圖2），并通過提取得到了黃芩苷鎂，其溶解度比黃芩苷提高了2 225 倍［6]，并已獲國家發(fā)明專利和美國專利授權(quán)［7]。

圖2 黃芩苷鎂鹽結(jié)構(gòu)式

深入研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對病毒性肝炎、酒精肝、化學(xué)性肝損傷、肝纖維化、肝衰竭、肝癌等具有一定的作用［8]，在臨床上已有黃芩苷片、黃芩苷膠囊等制劑，主要用于治療急慢性肝炎。無論是單體給藥還是復(fù)方給藥，黃芩苷在體內(nèi)均呈二房室模型，半衰期相對較短（約15 min），消除半衰期相對較長（約200 min），這種藥代動力學(xué)特征適合靜脈給藥系統(tǒng)［9]。黃芩苷鎂鹽作為黃芩苷的原本存在形式，前期研究表明其藥代動力學(xué)特征與黃芩苷相同［10]，而且水溶性好，毒性低，適合做成注射劑，具有很大的成藥性和臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)制備了黃芩苷鎂鹽凍干粉，并測定其含量?？紤]到臨床靜脈給藥的特點(diǎn)，擬進(jìn)行配伍穩(wěn)定性試驗(yàn)，考察它在生理鹽水、5% 葡萄糖溶液、10% 葡萄糖溶液中的穩(wěn)定性。

近期研究表明，黃芩苷對CCl4所致肝細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與其誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)及抑制促炎介質(zhì)有關(guān)［11-12]。同時也有研究表明，鎂離子能夠降低肝損傷小鼠肝指數(shù)、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性、MDA 水平，對抗和清除自由基，提高氧化酶活性，抑制TNF-α 分泌［13]。黃芩苷鎂鹽含有鎂離子，但黃芩苷在發(fā)揮對肝臟損傷的保護(hù)作用同時，鎂離子對肝損傷的保護(hù)是否存在協(xié)同作用尚不明確，需作進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 儀器 N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（日本理化公司）；LGJ-22D 冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；1260HPLC 色譜儀（美國安捷倫科技公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠）；PH 計（瑞士梅特勒-托利多公司），SPESTRO star Nano 全波長酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH 公司）；HP-8453 分光光度計（美國惠普公司）；全自動脫水機(jī)（北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；Histocore Arcadia C 石蠟包埋機(jī)、RM2235 cwEU 切片機(jī)（上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司）；Nikon DS-Fi1 電子顯微鏡（日本尼康株式會社）；Velocity 14R 高速低溫離心機(jī)（英國Dynamica 公司）；SCIEN-48 高通量組織研磨機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；AG-A254 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；JA-2003 電子天平（上海精科天平有限公司）；KQ-300 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GHX-9080B 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑 黃芩苷原料藥（承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)霧靈藥業(yè)有限責(zé)任公司）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201318，純度≥93.3%）。氫氧化鎂（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；生理鹽水、5%葡萄糖、10%葡萄糖注射液（石家莊四藥有限公司）；異甘草酸鎂注射液（連云港正大天晴藥業(yè)股份有限公司）；硫酸鎂、四氯化碳（天津歐博凱化工有限公司）；橄欖油（山東魯花集團(tuán)有限公司）。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ALT、AST、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GSH 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。娃哈哈純凈水（高碑店娃哈哈啟力飲料有限公司）；氨基甲酸乙酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物 wistar 大鼠36 只，雄性，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，在屏障動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，控制室內(nèi)溫度20～22 ℃，相對濕度50%～60%，光照時間8：00 至20：00，給予充足的飼料和飲用水。本實(shí)驗(yàn)所涉及的動物相關(guān)操作嚴(yán)格遵守有關(guān)準(zhǔn)則，并經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 注射用黃芩苷鎂鹽凍干粉的制備 在500 mL 圓底燒瓶中先后加入黃芩苷原料藥5 g、氫氧化鎂0.138 g、蒸餾水200 mL，將圓底燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，60 ℃水浴，低速旋轉(zhuǎn)1 h，反應(yīng)完全后為棕黃色溶液，抽濾，除去不溶性雜質(zhì)，活性炭吸附除去熱源，過0.45 μm 濾膜，固體物冷凍干燥40 h，得黃芩苷鎂鹽凍干粉。

2.2 HPLC 分析

2.2.1 色譜條件 參考2015 年版《中國藥典》 相關(guān)規(guī)定，黃芩苷鎂鹽分析方法為phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸（60∶40）；檢測波長278 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 分別取供試品溶液和生理鹽水注射液，黃芩苷鎂鹽加生理鹽水注射液，5%、10%葡萄糖注射液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，結(jié)果見圖3。由此可知，3 種溶劑對測定無影響。

圖3 黃芩苷鎂鹽HPLC 色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取一定量黃芩苷對照品，配制成500 μg/mL 貯備液，稀釋成22.08、22.16、70.656、85.56、176.64、353.28 μg/mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，將質(zhì)量濃度X 與峰面積Y 進(jìn)行回歸，得方程Y=35.51X+132.27（r=0.999 1），在22.08～353.28 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 方法學(xué)考察 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下分別考察精密度、重復(fù)性、加樣回收率，測得精密度RSD 為0.90%（n=6）；重復(fù)性RSD 為1.38%（n=6）；平均加樣回收率為100.24%，RSD 為1.06%（n=6），均符合要求。

2.3 注射用黃芩苷鎂鹽在不同溶劑中的穩(wěn)定性 精確稱取黃芩苷鎂鹽140.0、213.0、427.0 mg 各3 份，分別溶于250 mL 生理鹽水注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液中并充分?jǐn)嚢瑁?5 ℃水浴中于0、0.5、1、2、4、6、8 h 觀察外觀變化，測定溶液pH 值及黃芩苷鎂鹽含量，結(jié)果見圖4。由此可知，在0～8 h 內(nèi)各組pH 值略有下降，穩(wěn)定在6.6～7.2 之間；各組約有5% 的黃芩苷鎂鹽被破壞，穩(wěn)定性較好，無氣泡沉淀產(chǎn)生，顏色無變化，溶液澄清透明，達(dá)到了注射液的一般質(zhì)量要求。

圖4 不同濃度黃芩苷鎂鹽在各溶劑中的pH、含量變化

2.4 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、黃芩苷鎂鹽組、異甘草酸鎂組、黃芩苷組、硫酸鎂組，每組6 只，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)選擇給藥量為50 mg/kg。黃芩苷和硫酸鎂組（以鎂離子計）給藥劑量以黃芩苷鎂鹽組為標(biāo)準(zhǔn)，分別等量換算為48.8、1.3 mg/kg。異甘草酸鎂注射液臨床上治療急性肝損傷指導(dǎo)用藥量為0.2 g/d，按式（1）換算大鼠給藥劑量為18 mg/kg（Km為表面積和體質(zhì)量的比值，人為37，大鼠為6）。設(shè)計給藥方式為每天2 次，每次按給藥劑量一半尾靜脈注射給藥，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥1 周，記錄大鼠攝食量和飲水量。末次給藥2 h 后，空白組大鼠腹腔注射橄欖油（等量），其他各組大鼠腹腔注射50%CCl4（橄欖油稀釋）1 ml/kg，禁食，自由飲水。

2.4.2 取材 造模24 h 后，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯10 mg/kg 麻醉，腹主動脈取血5 mL，冰浴靜置1 h，離心（4 ℃、3 000 r/min）10 min，取上清測定ALT 和AST水平。取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗2 次，擦拭干凈后稱重，計算肝指數(shù)，結(jié)果見表1。取肝左葉，用10%甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，于光鏡下觀察肝組織病理變化，結(jié)果見圖5。剩余肝組織加入9 倍量生理鹽水制得10%肝組織勻漿，離心（4 ℃、3 000 r/min）10 min，取上清液測定MDA、GSH 水平。

2.4.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件處理，計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

由表1 可知，與空白組比較，模型組ALT、AST 活性和肝指數(shù)增高（P＜0.01），表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，給藥組大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)均有不同程度的降低（P＜0.01，P＜0.05）；黃芩苷鎂組血清中ALT、AST 活性低于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05，P＜0.01），肝指數(shù)低于黃芩苷組（P＜0.05）。

表1 用藥組對肝損傷大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)的影響（，n=6）

表1 用藥組對肝損傷大鼠血清ALT、AST 活性和肝指數(shù)的影響（，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，＃＃P＜0.01；與黃芩苷鎂鹽組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

由表2 可知，與空白組比較，模型組肝臟中的MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組MDA 水平均有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），黃芩苷鎂組中MDA水平低于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05）。與空白組比較，模型組GSH 水平降低（P＜0.01），黃芩苷鎂鹽組GSH 水平高于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 用藥組對肝損傷大鼠肝組織MDA、GSH 水平的影響（，n=6）

表2 用藥組對肝損傷大鼠肝組織MDA、GSH 水平的影響（，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，＃＃P＜0.01；與黃芩苷鎂鹽組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

圖5 顯示，空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無炎細(xì)胞浸潤。模型組肝索排列紊亂，細(xì)胞間隙變大，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，呈脂肪性泡沫病變。黃芩苷鎂組肝細(xì)胞病變不明顯，肝細(xì)胞輕度腫脹，部分肝細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)有少量炎細(xì)胞浸潤。異甘草酸鎂組依然可見氣球樣病變，肝臟保護(hù)效果不及黃芩苷鎂組。黃芩苷組和硫酸鎂組也可降低肝細(xì)胞腫脹和組織病變程度，但病變程度均大于黃芩苷鎂鹽組。

圖5 各組肝損傷大鼠肝病理切片（HE，×100）

4 討論

注射劑的配伍液穩(wěn)定性問題主要體現(xiàn)在室溫條件下溶液顏色變化、產(chǎn)生氣泡及產(chǎn)生不溶性微粒、pH 值的變化，一定溫度和時間內(nèi)溶液澄明、顏色無改變、無氣泡及肉眼可見的沉淀產(chǎn)生，pH 值穩(wěn)定，提示藥物可配伍。除了從溶液外觀、pH 值等理化性質(zhì)方面考察配伍穩(wěn)定性外，還測定了藥物在溶劑中的含量變化，結(jié)果顯示不同濃度黃芩苷鎂鹽在生理鹽水、5%葡萄糖、10%葡萄糖注射液中理化性質(zhì)和含量保持穩(wěn)定。在配伍穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上將黃芩苷鎂鹽溶解于生理鹽水注射液中，配制成一定濃度的注射液開展保肝作用研究。

肝臟是人體的重要器官，目前數(shù)以百萬計的人因酒精、化學(xué)品和感染而使肝臟遭受損害，其中化學(xué)物質(zhì)諸如對乙酰氨基酚、CCl4、亞硝胺和多環(huán)芳烴等對肝臟的損害很大。CCl4所致的肝損傷是肝損傷模型的首選，它可引起與肝硬化或肝炎相同的肝臟改變、單個核細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞脂肪性泡沫變性。CCl4誘導(dǎo)的肝毒性被認(rèn)為涉及2 個階段，最初階段是由細(xì)胞色素P450 代謝CCl4，導(dǎo)致自由基的形成和脂質(zhì)過氧化［14]；第二階段由于自由基引起Kupffer 細(xì)胞激活，并伴隨炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［15]。由于肝損傷，肝細(xì)胞膜的滲透性改變，膜的滲透性改變導(dǎo)致細(xì)胞中的酶釋放到體循環(huán)。其中ALT 在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞漿合成，其血清中活性增高提示肝細(xì)胞膜破壞和肝細(xì)胞通透性增加。AST 在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞線粒體合成，其血清中活性增高提示肝細(xì)胞線粒體損傷。本研究中，大鼠腹腔注射CCl424 h 后，模型組血清中ALT和AST 水平明顯增高，而黃芩苷鎂鹽可以減緩這種趨勢。

MDA 是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，它在血清及組織中的水平高低反映了組織過氧化時的損傷程度［16]。因此，肝組織內(nèi)MDA 水平的變化可反映肝損害的程度及治療后肝功能恢復(fù)的情況。GSH 是抵抗自由基的第一道防線，是組織氧化損傷易感性的重要決定因素，關(guān)于CCl4肝毒性機(jī)制研究表明，GSH 在CCl4活性毒性代謝產(chǎn)物的解毒中起著關(guān)鍵作用，肝壞死始于GSH 儲存的耗盡［17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩苷鎂鹽能顯著降低肝組織中MDA 水平，減緩大鼠GSH 水平的降低，與陽性對照藥異甘草酸鎂效果相當(dāng)，明顯優(yōu)于等濃度的黃芩苷組和硫酸鎂組。

黃芩苷具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠清除和抑制自由基，保護(hù)線粒體膜的完整性，此外還能夠促進(jìn)血紅素對氧酶-1（HO-1）和過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）的表達(dá)，下調(diào)TGFβ1信號通路抑制肝星狀細(xì)胞活化［18]，同時能夠抑制炎癥介質(zhì)因子表達(dá)。CCl4可通過抑制細(xì)胞膜上和線粒體膜上鈣離子泵的活性使鈣離子大量內(nèi)流，激活肝細(xì)胞膜上的磷酸化酶從而引起膜的脂質(zhì)過氧化［19]。鎂是體內(nèi)重要的常量元素，是鈣的天然拮抗劑，它能影響鈣的膜滲透性及其結(jié)合、分布和交換，通過減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載達(dá)到肝保護(hù)作用。臨床報道，肝損傷往往伴隨低鎂血癥，適當(dāng)補(bǔ)充鎂離子改善低血鎂癥對肝細(xì)胞有保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用，并優(yōu)于等濃度的黃芩苷和硫酸鎂，其結(jié)構(gòu)中的黃芩苷和鎂離子存在協(xié)同作用而共同達(dá)到保肝效果。其中，黃芩苷主要通過阻斷自由基的脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)制、增生及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化，恢復(fù)肝細(xì)胞生物氧化功能，促進(jìn)相關(guān)蛋白質(zhì)合成，為肝臟再生和修復(fù)提供相應(yīng)的能量。同時，鎂離子可以有效抑制肝細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化。

黃芩苷鎂鹽作為黃芩苷的原本存在形式，本身水溶性較好，在以上3 種溶劑中的理化性質(zhì)和含量保持穩(wěn)定，具有很大的成藥性和臨床應(yīng)用前景。因此，黃芩苷鎂鹽作為治療人類氧化應(yīng)激和炎癥性肝病的一種可能的治療手段值得研究，在臨床上的應(yīng)用潛力也有待進(jìn)一步探討。