天南星炮制成膽南星的“減毒改性”作用

單麗倩，劉曉峰，崔亞晨，劉 悅，高 慧

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

天南星是天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.、異葉天南星Arisaema heterophyllum Blume.或東北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥塊莖，有溫化寒痰、祛風(fēng)止痙之功效。膽南星為制天南星細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或?yàn)樯炷闲羌?xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成［1]，長于清熱化痰、息風(fēng)定驚，多用于痰熱咳嗽、急驚風(fēng)、癲癇等癥。天南星經(jīng)發(fā)酵后制成膽南星，是炮制對改變藥性最典型的例子，性由溫轉(zhuǎn)涼，味由辛轉(zhuǎn)苦，功效由溫化寒痰轉(zhuǎn)為清化熱痰，且毒性降低。

關(guān)于膽南星的炮制作用，歷代本草學(xué)著作中多有記載，如“天南星為燥痰之品，制以牛膽以殺其毒。得牛膽則燥性減，且膽有益肝膽之功”［2]、“膽南星……降痰因火動如神，治小兒急驚必用……較之南星味苦性涼，故善解風(fēng)痰熱滯……”［3]等。在現(xiàn)代研究中，有人基于小鼠生理生化指標(biāo)對天南星、膽南星的藥性變化進(jìn)行探討［4]，另有實(shí)驗(yàn)證明天南星具有顯著毒性［5]，但未見對天南星、膽南星傳統(tǒng)藥效和毒性的系統(tǒng)對比研究。本課題組前期對膽南星中化學(xué)成分進(jìn)行了對比研究［6]，并對發(fā)酵前后的膽酸類成分含有量進(jìn)行了比較，證明了發(fā)酵后結(jié)合型膽酸轉(zhuǎn)化為游離型膽酸，確立了膽南星的發(fā)酵工藝，并建立了用3 種游離型膽酸含有量評價(jià)膽南星質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)［7]。本實(shí)驗(yàn)圍繞膽南星的傳統(tǒng)功效，分別從抗高熱驚厥、清熱以及毒性三個(gè)方面，對天南星發(fā)酵前后的藥效、毒性進(jìn)行對比研究，以從傳統(tǒng)藥效學(xué)方面驗(yàn)證天南星發(fā)酵“減毒改性”的炮制理論，為進(jìn)一步研究天南星的炮制原理提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-080 型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HZ-A6002 型電子天平（HZ-A6002 型，瑞安市金訊貿(mào)易有限公司監(jiān)制）；酶標(biāo)儀（MuLtiskan Mk3型，上海賽默飛世爾儀器有限公司）；醫(yī)用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥物及試劑 東北天南星采自遼寧省本溪市，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院王維寧教授鑒定為天南星科植物東北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥塊莖，采后凈制，洗去泥沙并切制成2～3 mm 厚片，晾干，即得。豬膽汁購于大連礎(chǔ)明集團(tuán)有限公司。大鼠前列腺素E2（PGE2）試劑盒（生產(chǎn)批號 BPE35446）、大鼠鈉鉀ATP酶（Na+/K+ATPase）試劑盒（批號BPE30580）、大鼠琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（批號 BPE30230）、大鼠肝糖原（Glycogen）試劑盒（批號20171116HE）、大鼠白細(xì)胞介素-1 β（IL-1β）試劑盒（批號BPE30419）、大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號BPE30666）購自上海朗頓生物科技有限公司；干酵母粉（產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)代號GB/T20886，湖北安琪酵母股份有限公司）；PBS（批號P1020-500，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 動物 SPF 級21 日齡雄性SD 大鼠48 只（體質(zhì)量60～80 g）；SPF 級雄性SD 大鼠32 只（體質(zhì)量180～220 g）；SPF 級KM 小鼠80 只，雌雄各半（體質(zhì)量18～22 g），均購自遼寧長生生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2017-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房。本實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的所有相關(guān)操作均在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行，批準(zhǔn)號2018YS（DW）-043-01。

1.4 樣品制備 天南星鮮品：取天南星塊莖，洗去泥沙，即得。天南星：取天南星塊莖，洗去泥沙，切制成2～3 mm厚片，晾干，即得。膽南星：取天南星細(xì)粉過五號篩，加入凈膽汁（經(jīng)絹布濾過），經(jīng)1∶1 比例混合，置32 ℃、80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d 取出，至蒸制容器中蒸1 h 至透，趁熱切成1.5～2 cm 的小塊，曬至黑褐色，即得［7]。

2 方法

2.1 樣品水煎液制備 抗驚厥實(shí)驗(yàn)用藥：取適量天南星、膽南星，用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成中劑量（0.14 g 生藥/mL）、高劑量（0.28 g 生藥/mL）水煎液。解熱實(shí)驗(yàn)用藥：取適量天南星、膽南星，用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成0.28 g 生藥/mL 水煎液。毒性實(shí)驗(yàn)用藥：取適量天南星搗碎，加水制成低劑量（0.18 g 生藥/mL）、中劑量（0.25 g 生藥/mL）、高劑量（0.32 g 生藥/mL）溶液；天南星、膽南星用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成低劑量（0.18 g 生藥/mL）、中劑量（0.25 g 生藥/mL）、高劑量（0.32 g 生藥/mL）水煎液。

2.2 抗驚厥實(shí)驗(yàn) 取48 只21 日齡SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別為空白組、模型組以及天南星中、高劑量組和膽南星中、高劑量組。給藥組大鼠按1.4、2.8 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥，空白組、模型組給予等容量生理鹽水，連續(xù)7 d。于第7 天灌胃給藥后1 h后測肛溫，參照周國平等［8]建立的45 ℃熱水浴誘發(fā)的大鼠驚厥模型，將除空白組外其余各組大鼠置于（45±2）℃熱水浴中，誘發(fā)驚厥發(fā)作，驚厥發(fā)生后立即從水中撈出大鼠。觀察各組大鼠驚厥發(fā)生數(shù)、驚厥死亡數(shù)、驚厥潛伏期（從進(jìn)入熱水浴至驚厥發(fā)作的時(shí)間）、驚厥持續(xù)時(shí)間和驚厥誘發(fā)結(jié)束時(shí)肛溫并計(jì)算驚厥發(fā)生率、驚厥致死率和肛溫上升速度，肛溫上升速度=（驚厥誘發(fā)結(jié)束時(shí)肛溫-驚厥誘發(fā)開始時(shí)肛溫）/驚厥潛伏期，規(guī)定驚厥最大觀察時(shí)間為5 min［9]。

2.3 解熱實(shí)驗(yàn) 取32 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，于正式實(shí)驗(yàn)前3 天在每日上午9 時(shí)測定大鼠體溫，選取體溫在36.6～38.3 ℃之間、正常波動小于0.2 ℃的大鼠作為正常實(shí)驗(yàn)大鼠，末次測量體溫之后隨機(jī)將大鼠隨機(jī)分為4 組，每組8 只，分別為空白組、模型組、天南星組、膽南星組。給藥組大鼠按2.8 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。于給藥第7 天，分別測量晨起肛溫，空白組皮下注射生理鹽水，其余組均按10 mL/kg劑量皮下注射20% 干酵母混懸液造模［10]。造模30 min后，各組灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組給予生理鹽水，測量給藥后0、1、2、3、4、5、6 h 的肛溫，并于末次測量后，用乙醚麻醉大鼠，斷頭處死，隨后立即在冰浴中取腦，切取下丘腦組織并加PBS 溶劑勻漿置冷凍室內(nèi)保存，測定各給藥組下丘腦組織中前列腺素E2（PGE2）的水平；取肝組織并稱重，切取部分肝組織加PBS 溶劑勻漿后置冷凍室內(nèi)保存，測定各給藥組肝臟組織中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）以及肝糖原（Glycogen）的水平；腹主動脈取血，置于EP 管中，3 800 r/min離心20 min，吸取血清上清液，測定各給藥組血清中炎癥因子白胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1 β（IL-1 β）的水平。

2.4 毒性實(shí)驗(yàn) SPF 級KM 小鼠80 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為10 組，每組8 只，分別為空白組，天南星鮮品高、中、低劑量組及天南星高、中、低劑量組和膽南星高、中、低劑量組，受試動物實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，空白組灌胃等體積生理鹽水，給藥組按1.8、2.5、3.2 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥2 次，時(shí)間間隔為12 h。灌胃后各組小鼠自由攝取標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，自由飲水，密切觀察小鼠的行為活動、精神狀態(tài)、攝食飲水、皮毛光澤、糞便尿液、呼吸情況、鼻、眼、口腔有無異常分泌物等情況，并記錄小鼠死亡情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析與組間t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 天南星發(fā)酵前后抗高熱驚厥作用結(jié)果 與模型組相比，除天南星高劑量組外，各給藥組均能夠降低幼齡SD大鼠由高熱引起的驚厥發(fā)生率，且天南星高劑量組具有一定的致死率，可能與天南星具有毒性有關(guān)；與天南星組相比，高劑量膽南星組能顯著降低驚厥發(fā)生率，在同樣發(fā)生驚厥的中劑量組中，膽南星組能夠明顯降低驚厥發(fā)生率，縮短驚厥持續(xù)時(shí)間，降低肛溫上升速度，說明天南星經(jīng)發(fā)酵炮制后可明顯增強(qiáng)抗高熱驚厥作用。見表1。

表1 各組藥物對幼齡SD 大鼠驚厥發(fā)生率、驚厥致死率、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時(shí)間以及肛溫上升速度的影響（，n=8）

表1 各組藥物對幼齡SD 大鼠驚厥發(fā)生率、驚厥致死率、驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時(shí)間以及肛溫上升速度的影響（，n=8）

注：-代表未驚厥。與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；中劑量天南星發(fā)酵前后比較，＃＃P＜0.01；天南星中、高劑量組比較，aaP＜0.01。

3.2 天南星發(fā)酵前后解熱作用結(jié)果

3.2.1 天南星發(fā)酵前后肛溫變化 給藥0～6 h 期間，與空白組比較，模型組肛溫持續(xù)增加，3 h 之后體溫升高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組相比，天南星組與模型組無顯著性差異，說明天南星并沒有解熱作用，符合天南星作為熱性藥的性質(zhì)，膽南星組肛溫降低（P ＜0.05，P＜0.01），說明膽南星有良好的解熱作用；天南星組與膽南星組相比，于給藥2 h 后膽南星組肛溫低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01），證明經(jīng)加膽汁發(fā)酵炮制后，膽南星有良好的解熱作用，說明了膽汁以寒制熱的作用。見表2。

表2 各組藥物對各組SD 大鼠肛溫變化情況（，n=8）

表2 各組藥物對各組SD 大鼠肛溫變化情況（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；天南星發(fā)酵前后比較，aP＜0.05，aaP＜0.01。

3.2.2 天南星發(fā)酵前后對大鼠下丘腦組織中前列腺素E2（PGE2）的影響 與空白組相比，模型組大鼠下丘腦組織中PGE2水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，天南星組水平相差不大，膽南星組水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

3.2.3 天南星發(fā)酵前后各給藥組血清中炎癥因子白胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1 β（IL-1 β）的表達(dá) 與空白組相比，模型組IL-6、IL-1 β 水平顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，天南星組IL-6、IL-1 β 水平相差不大，膽南星組IL-6、IL-1 β 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組IL-6、IL-1 β 水平低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 藥物對SD 大鼠下丘腦組織PGE2 及血清IL-6、IL-1β 的影響（，n=8）

表3 藥物對SD 大鼠下丘腦組織PGE2 及血清IL-6、IL-1β 的影響（，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；天南星發(fā)酵前后比較，aP＜0.05，aaP＜0.01。

3.2.4 天南星發(fā)酵前后各給藥組肝臟組織中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）以及肝糖原（Glycogen）的代謝 與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH 水平增加，Glycogen 水平降低（P＜0.05，P ＜0.01）；與模型組相比，天南星組Na+/K+ATPase、SDH 以及Glycogen 水平相差不大，膽南星組Na+/K+ATPase、SDH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），Glycogen水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組Na+/K+ATPase、SDH 水平降低，Glycogen 水平高于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 藥物對大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH、Glycogen 代謝的影響（，n=8）

表4 藥物對大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH、Glycogen 代謝的影響（，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；天南星發(fā)酵前后比較，aaP＜0.01。

由以上肛溫變化情況、下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞、肝臟組織能量代謝以及血清中炎性因子的對比，能夠發(fā)現(xiàn)天南星組與模型組相比無顯著性差異，說明天南星是熱性藥，無解熱作用。膽南星與模型組有顯著性差異，且向空白組接近，說明膽南星具有良好的解熱作用。

3.3 天南星發(fā)酵前后毒性作用結(jié)果 各組動物在第二次灌胃后6 h 內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的怠動、豎毛、聚堆、靜止俯臥、呼吸急促或呼吸困難、身體震顫、抽搐至死亡。對死亡動物立即解剖，可見小鼠胃腸均有大量尚未吸收的藥液，個(gè)別小鼠胃底部有充血現(xiàn)象，其余臟器未見有明顯異常。第二次灌胃6 h 后大部分存活動物開始逐漸進(jìn)食飲水，第三天開始各組小鼠飲食進(jìn)水恢復(fù)正常。天南星本身具有毒性，可致小鼠死亡，且天南星鮮品組死亡率高于天南星組，說明天南星經(jīng)發(fā)酵炮制后，可有效降低死亡率，使毒性降低。見表5。

表5 藥物對動物死亡情況的影響

4 討論

天南星經(jīng)發(fā)酵制成膽南星后，藥性由溫轉(zhuǎn)涼，毒性降低。這一炮制作用在古代各大醫(yī)書中均有大量記載，但在現(xiàn)代研究中，欠缺炮制前后藥效及毒性對比研究，無法解釋其炮制原理?？垢邿狍@厥和清熱作為膽南星典型的藥理作用，能夠直觀的對比出兩者在傳統(tǒng)藥效方面的區(qū)別，比較貼合膽南星實(shí)際應(yīng)用情況；毒性實(shí)驗(yàn)則能直觀的對比出兩者毒性強(qiáng)弱。所以本實(shí)驗(yàn)從藥效和毒性兩方面系統(tǒng)闡述了天南星炮制前后的變化，從而驗(yàn)證天南星發(fā)酵“減毒改性”的炮制原理。

膽南星臨床上常用于治療小兒高熱驚厥［11]，故本實(shí)驗(yàn)?zāi)M小兒高熱致驚厥的模型，選用幼齡的SD 大鼠，并用熱水浴誘發(fā)驚厥，以最大程度的還原膽南星在臨床中的應(yīng)用情況［12]。將驚厥發(fā)生率作為最直接的觀察指標(biāo)用以評價(jià)抗驚厥作用強(qiáng)弱。膽南星抗高熱驚厥作用明顯強(qiáng)于天南星，膽南星不僅在抗驚厥作用上強(qiáng)于天南星，還可降低肛溫上升速度，從側(cè)面輔助證明了膽南星的解熱作用。

解熱作用機(jī)理之一是使下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的PGE2水平降低［13]，或使大鼠肝組織Na+/K+ATPase 的水平降低、SDH 活力降低、升高肝糖原水平，而IL-6、IL-1 β 作為重要的抗炎癥細(xì)胞因子［14-16]，發(fā)熱會導(dǎo)致其水平增加，故解熱實(shí)驗(yàn)中選定上述指標(biāo)進(jìn)行比較。對于干酵母所引起的發(fā)熱，膽南星組可有效降低大鼠體溫，降低發(fā)熱大鼠的PGE2、Na+/K+ATPase、IL-6、IL-1 β 和SDH 水平，增加肝糖原含量，而天南星則未表現(xiàn)出解熱作用。說明天南星在加入膽汁進(jìn)行發(fā)酵制成膽南星后，具備了膽汁中寒涼的藥性，產(chǎn)生了解熱作用，體現(xiàn)了熱性藥向寒性藥的轉(zhuǎn)變，證明了炮制改性的原理。

因?yàn)樵诋a(chǎn)地采收、加工天南星鮮品時(shí)，天南星鮮品表現(xiàn)出極明顯的對皮膚的刺痛作用，我們在對比天南星、膽南星毒性時(shí)增加了天南星鮮品組。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，天南星鮮品有明顯的毒性，而天南星、膽南星組均受給藥體積和濃度的限制，給到最大濃度仍然無法致全部死亡，無法得到Dm、Dn、LD50等數(shù)據(jù)，故正式實(shí)驗(yàn)對不同樣品對小鼠致死率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，天南星鮮品具有明顯的毒性，經(jīng)干燥后毒性有所降低，進(jìn)一步發(fā)酵制成膽南星后毒性大大降低，體現(xiàn)了天南星的“炮制減毒”。

本實(shí)驗(yàn)通過對天南星發(fā)酵前后的傳統(tǒng)藥效及毒性比較，證明了天南星發(fā)酵炮制后藥性由熱轉(zhuǎn)涼，增強(qiáng)抗高熱驚厥作用，產(chǎn)生顯著的解熱作用，并使毒性降低，驗(yàn)證了炮制“減毒改性”的原理。