基于“TF-miRNA”反饋環(huán)探討活血榮絡(luò)方對腦梗死大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

楊仁義，顏思陽，周德生，高曉峰，傅馨瑩，龔翠蘭，劉利娟*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

卒中作為最常見的腦血管病之一，是我國第一大死亡原因［1-2]?！吨袊渲蟹乐螆蟾?019》［3]數(shù)據(jù)顯示，我國總體卒中終生發(fā)病風(fēng)險為39.9%，位居全球首位，其中腦梗死約為82%，嚴(yán)重威脅居民身體健康［4]。目前全世界公認(rèn)的腦梗死有效治療為靜脈溶栓、機(jī)械取栓，但嚴(yán)格的時間窗或副作用限制了其應(yīng)用。腦梗死屬中醫(yī)“缺血性中風(fēng)”范疇，榮氣［5]是一切精微物質(zhì)的總稱，歸臟腑之氣，而榮氣虛滯［6]是缺血性中風(fēng)的關(guān)鍵病機(jī)?；跇s氣理論創(chuàng)制的活血榮絡(luò)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，納入臨床路徑已12 年，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)［7-10]活血榮絡(luò)方能降低Glu、Asp、CF6、Ca2+、CD62p 等水平，升高GABA、Gly 等水平，有效抑制血小板聚集、清除氧自由基等，從而改善腦梗死后痙攣性癱瘓、認(rèn)知能力、神經(jīng)功能癥狀；前期實驗研究發(fā)現(xiàn)［11-15]活血榮絡(luò)方能上調(diào)Caveolin-1、CD31+、下調(diào) MMP-9 表達(dá)，激活JAK2/STAT3 信號通路，減輕腦梗死急性期炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生，改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損。但活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的腦保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，因此本項目結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)與大鼠腦缺血再灌注模型，以篩選出的“轉(zhuǎn)錄因子（TF）-微小RNA（miRNA）”反饋環(huán)為機(jī)制，在RNA 水平研究活血榮絡(luò)方改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 10～12 周齡SPF 級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40 只，體質(zhì)量230～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，晝夜交替各12 h，溫度21～26 ℃，相對濕度40%～50%。實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（20201010-13），操作均按照美國國立衛(wèi)生研究院制定的實驗動物使用指南標(biāo)準(zhǔn)［16]。

1.2 試劑與藥物 活血榮絡(luò)方（湘藥制字Z20080472），組方藥材雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g，均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)本院張裕民主任藥師鑒定為正品，質(zhì)量均符合2020 年版《中國藥典》 規(guī)定。制備方法為將乳香、沒藥粉碎，其余藥材混合，10倍量水浸泡12 h 后煎煮2 h，第2 次加8 倍量水煎煮1 h，第3 次加5 倍量水煎煮1 h，合并3 次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮冷卻，即得，4 ℃下保存?zhèn)溆?。根?jù)人動物體表面積換算法，用蒸餾水將活血榮絡(luò)方浸膏稀釋為每1 mL 含1.1 g 生藥的藥液，按1 mL/100 g 劑量灌胃。丁苯酞軟膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批號H20050299）。RNA提取試劑盒、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為 G3013、G3330、G3322）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號分別為10006818、80109218、10009218）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（美國HyClone 公司，貨號SH30538.02）。

1.3 儀器 石蠟切片機(jī)（美國Thermo Scientific 公司）；顯微成像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；超微量分光光度計（美國Thermo 公司）；臺式高速冷凍型微量離心機(jī)［大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

2 方法

2.1 腦梗死差異miRNA（DEMs）及差異基因（DEGs）的GEO 數(shù)據(jù)挖掘

2.1.1 數(shù)據(jù)檢索與下載 通過美國國家圖書館（NCBI）基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO 子數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Cerebral Infarction”或“Cerebral Ischemia”為檢索詞，獲取腦梗死m(xù)iRNA（如GSE97532）與mRNA（如GSE119121）微陣列分析數(shù)據(jù)，下載數(shù)據(jù)集中表達(dá)矩陣文件。

2.1.2 數(shù)據(jù)歸一化 采用R 語言，利用Xi=［Xi-min（X1～n）] ∕［max（X1～n）-min（X1～n）]公式將表達(dá)矩陣進(jìn)行歸一化處理。

2.1.3 DEMs 與DEGs 挖掘 采用R 語言“l(fā)imma包”對表達(dá)矩陣（如GSE97532、GSE119121）分別進(jìn)行差異分析，以｜ logFC ｜ ＞1；P-value＜0.05為篩選條件確定DEMs 與DEGs，分別繪制DEMs熱圖、DEGs 火山圖。

2.2 DEMs 反向靶基因與正向轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測及對“TF-miRNA”反饋環(huán)的構(gòu)建 TF 的翻譯合成受miRNA 調(diào)控，同時TF 具有轉(zhuǎn)錄miRNA 的功能，所以特定的TF 與miRNA 可形成“TF-miRNA”反饋環(huán)在疾病中發(fā)揮作用。

2.2.1 DEMs 反向靶基因預(yù)測 通過TargetScans［17]（http：//www.targetscan.org）、starBase［18]（http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/）數(shù)據(jù)庫對miRNA 反向靶基因進(jìn)行預(yù)測，整合算法與實驗驗證的DEMs 反向靶基因。

2.2.2 DEMs正向TF 預(yù)測通過 TransmiR v2.0［19-20]數(shù)據(jù)庫（http：//www.cuilab.cn/transmir）對miRNA 正向TF 進(jìn)行反向預(yù)測，整合算法與實驗驗證的DEMs 正向TF。

2.2.3 “TF-miRNA”反饋環(huán)中TF 聚焦 通過韋恩圖取“DEGs”“DEMs 反向靶基因”“DEMs 正向TF”三者的交集，以獲取反饋環(huán)中特定TF。

2.2.4 “TF-miRNA”反饋環(huán)中miRNA 聚焦 根據(jù)聚焦出的特定TF，結(jié)合TransmiR v2.0 數(shù)據(jù)，在DEMs 中檢索特定miRNA。

2.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，術(shù)前12 h 禁食不禁水。以10%水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，參考Longa 等［21]報道的大腦中動脈阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）梗阻大鼠右側(cè)中動脈，鈍性分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），從ECA 與ICA 分叉部約（4±2）mm 處剪口進(jìn)拴線，插入約（18±2）mm，將ICA 掛線系牢，缺血2 h 后，拔出拴線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組分離CCA、ECA、ICA，不插入拴線，其余過程同造模組，大鼠術(shù)后6 h 自由進(jìn)食飲水。參考Zea-Longa’s 級［21]標(biāo)準(zhǔn)評分法，取1～3 分大鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4 分組及給藥 將SD 大鼠隨機(jī)分為4 組，分別為假手術(shù)組、模型組、活血榮絡(luò)方組及丁苯酞組，每組各10 只，實驗過程中出現(xiàn)死亡、取材時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦出血剔除則根據(jù)需要予以補(bǔ)充。術(shù)后6 h 灌胃，活血榮絡(luò)方組予以活血榮絡(luò)方藥液［11]（11.7 g/kg），丁苯酞組予以丁苯酞混懸液（60 mg/kg），假手術(shù)組與模型組予以生理鹽水（10 mL/kg），每天固定時間點灌胃給藥1 次，連續(xù)7 d［13-14]。

2.5 改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）大鼠神經(jīng)功能采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）［22]進(jìn)行評價，包括運(yùn)動測試、感覺測試、平衡木測試、反射消失或動作異常共18 分，評分越高，損傷程度越嚴(yán)重，于1、3、7 d 開始。

2.6 蘇木素-伊紅（HE）染色與尼氏（Nissl）染色 大鼠腹主動脈采血后心臟灌注生理鹽水200 mL，換4% 多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中保存。腦組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（3 μm，冠狀位）、脫蠟、復(fù)水、染色（HE、Nissl 染色）等步驟后，顯微成像系統(tǒng)獲取腦組織神經(jīng)元圖像，參考丁元元等［23]報道，采用腦組織病理學(xué)評分表對大鼠HE染色進(jìn)行評價，評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 腦組織病理學(xué)評分Tab.1 Scores for brain tissue histopathological assessment

2.7 腦組織“TF-miRNA”反饋環(huán)miRNA、mRNA的檢測 采用熒光定量PCR（real-time PCR，RTPCR）法檢測腦梗死大鼠腦組織中“TF-miRNA”反饋環(huán)相關(guān)KLF4、KLF5、VEGF mRNA 及miR-206、miR-429 miRNA，取腦組織100 mg，用1 mL Trizol Reagent 提取腦組織總RNA，Nanodrop 2000檢測RNA 濃度及純度。采用RT First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2× qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmmol/L 基因引物1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL，預(yù)變 性95 ℃，10 min，循環(huán)（40 次）95 ℃，15 s 至60 ℃，60 s，熔解曲線60～95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。miRNA 以U6 為內(nèi)參，mRNA 以GAPDH 為內(nèi)參，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析，引物序列見表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（）表示，組間比較若符合正態(tài)性且方差齊性時，采用單因素方差分析LSD、SNK 法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時，采用Tamhane T2、Dunnett T3 法進(jìn)行方差檢驗和兩兩比較；若不符合正態(tài)性時，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DEMs、DEGs 篩選 采用R 語言“l(fā)imma 包”對GSE97532、GSE119121 表達(dá)矩陣進(jìn)行差異分析，將模型組與假手術(shù)組進(jìn)行對比以獲取DEMs、DEGs。DEMs（圖1）共有36 個，其中有27 個miRNA（miR-206、miR-429、miR-23a-5p 等）在模型組中高表達(dá)，9 個miRNA（miR-23b-5p、miR-181a、miR-107-5p 等）在模型組中低表達(dá)；DEGs（圖2）共有271 個，其中有169 個mRNA（KLF4、TLR2、KLF5 等）上調(diào)，102 個mRNA（CD79B、EBF1、HMGN3 等）下調(diào)。

圖1 DEMs 表達(dá)熱圖Fig.1 Heat map of DEMs expression

圖2 DEGs 表達(dá)火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs expression

3.2 DEMs 反向靶基因與正向轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及“TF-miRNA”反饋環(huán)構(gòu)建 采用TargetScans、starBase 預(yù)測出36 個DEMs 的反向靶基因（如TLR2、BNDF、STAT3 等）共13 764 個，采用TransmiR v2.0 數(shù)據(jù)庫預(yù)測出36 個DEMs 的正向TF（如 KLF4、KLF5、STAT3 等）共 309 個。取“DEGs”“DEMs 反向靶基因”“DEMs 正向TF”三者的交集（圖3），共獲取5 個腦梗死差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子基因，分別為 KLF4、KLF5、HMGN3、EBF1、TLR2。

圖3 “DEGs”“反向靶基因”與“正向TF”韋恩圖Fig.3 Venn diagrams for“DEGs”，“Downstream-Target-Genes”and“Upstream-TF”

根據(jù)聚焦出的5 個特定TF 結(jié)合TransmiR v2.0數(shù)據(jù)，在DEMs 中檢索特定TF 能轉(zhuǎn)錄的miRNA，其中TLR2 能轉(zhuǎn)錄的miRNA 與DEMs 無交集，取余下4 個特定TF 轉(zhuǎn)錄的miRNA 與DEMs 的交集，可初步構(gòu)成“TF-miRNA”反饋環(huán)（圖 4），即“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-544”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”“EBF1-miR-429”5 個“TF-miRNA”反饋環(huán)。KLF4、KLF5 屬于轉(zhuǎn)錄因子Kruppel 家族蛋白，在神經(jīng)再生、血管新生、細(xì)胞凋亡等機(jī)體修復(fù)生命進(jìn)程中發(fā)揮重要作用；EBF1 屬于早期B 細(xì)胞因子家族蛋白，主要與B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)，因此本研究以機(jī)體修復(fù)為切入點，采用分子和動物實驗方法，以“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”為重點研究對象，對生物信息學(xué)預(yù)測的“TF-miRNA”反饋環(huán)進(jìn)行初步驗證，同時為后續(xù)研究提供新機(jī)制及理論基礎(chǔ)。

圖4 “TF-miRNA”反饋環(huán)韋恩圖Fig.4 Venn diagrams for“TF-miRNA”feedback loop

3.3 改良神經(jīng)功能缺損評分 與假手術(shù)組比較，模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組1、3、7 d 評分升高（P＜0.01），神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組1 d 評分無明顯變化（P＞0.05），神經(jīng)功能缺損無明顯改善，3、7 d 評分降低（P＜0.01），神經(jīng)功能缺損改善，見表3。

表3 活血榮絡(luò)方對腦梗死大鼠1、3、7 d 神經(jīng)功能的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on rats’ neural function on the 1st，3rd and 7th days after cerebral infarction（，n=10）

表3 活血榮絡(luò)方對腦梗死大鼠1、3、7 d 神經(jīng)功能的影響（，n=10）Tab.3 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on rats’ neural function on the 1st，3rd and 7th days after cerebral infarction（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 HE、Nissl 染色 圖5A、5C 顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)完整、排列緊密、結(jié)構(gòu)清晰；與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元細(xì)胞固縮、數(shù)量減少、染色質(zhì)不均勻、部分細(xì)胞水腫、細(xì)胞間隙增寬（P ＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組神經(jīng)元損傷減輕、數(shù)量增多、水腫減輕、間隙變?。≒＜0.05，P＜0.01）；圖5B、5D 顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元完整，尼氏體結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常，數(shù)量較少，呈空泡樣變或壞死，尼氏小體數(shù)目減少（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)組、丁苯酞組神經(jīng)元形態(tài)好轉(zhuǎn)，損傷減輕，尼氏小體數(shù)目增多，染色均勻，間隙變?。≒＜0.05）。各組腦組織皮質(zhì)、海馬區(qū)病理學(xué)評分及尼氏小體數(shù)目見表4。

表4 各組腦梗死大鼠腦組織皮質(zhì)、海馬區(qū)病理學(xué)評分及尼氏小體數(shù)目比較（，n=5）Tab.4 Comparison of pathological scores and Nissl body counts in cerebral cortex and hippocampus of cerebral infarction rats among various groups（，n=5）

表4 各組腦梗死大鼠腦組織皮質(zhì)、海馬區(qū)病理學(xué)評分及尼氏小體數(shù)目比較（，n=5）Tab.4 Comparison of pathological scores and Nissl body counts in cerebral cortex and hippocampus of cerebral infarction rats among various groups（，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖5 各組腦梗死大鼠病理變化（×400）Fig.5 Pathological changes of cerebral infarction rats in various groups（×400）

3.5 大鼠腦組織“TF-miRNA”反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組大鼠腦組織KLF4、KLF5、VEGF mRNA、miR-206 與miR-429 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組與丁苯酞組KLF4 表達(dá)升高（P＜0.01），活血榮絡(luò)方組KLF5、VEGF 表達(dá)升高（P＜0.05），丁苯酞組KLF5、VEGF 表達(dá)升高（P ＜0.01），活血榮絡(luò)方組與丁苯酞組miR-206、miR-429 表達(dá)降低（P＜0.01），見表5。

表5 活血榮絡(luò)方對“TF-miRNA” 反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達(dá)的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of miRNA and mRNA in“TF-miRNA”feedback loop（，n=5）

表5 活血榮絡(luò)方對“TF-miRNA” 反饋環(huán)miRNA、mRNA 表達(dá)的影響（，n=5）Tab.5 Effects of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of miRNA and mRNA in“TF-miRNA”feedback loop（，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

“TF-miRNA”反饋環(huán)［24]是TF 與miRNA 之間存在的直接或間接的反饋調(diào)控關(guān)系。TFs 能轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，miRNA 能靶向抑制基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，腦梗死發(fā)生時，細(xì)胞中TFs 與miRNAs 會被廣泛影響，可構(gòu)成“TF-miRNA”反饋環(huán)，共同影響腦梗死疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫中挖掘出腦梗死相關(guān)DEGs 與DEMs，結(jié)合“TFmiRNA”反饋環(huán)模式，初步構(gòu)成“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-544”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”“EBF1-miR-429”5 個腦梗死相關(guān)“TFmiRNA”反饋環(huán)。反饋環(huán)中TF主要由KLF4、KLF5、EBF1 構(gòu)成，miRNA 主要由miR-206、miR-429、miR-544 構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn) KLF4［25-27]、KLF5［28]在缺血性腦損傷中被上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控主要與miRNA（miR-200b［29]、miR-195［28]等）的靶向抑制翻譯作用有關(guān)，而KLF4 的過表達(dá)能促進(jìn)miRNA（miR-200b、miR-183［30]等）的表達(dá)，KLF5的過表達(dá)促進(jìn)miRNA（miR-29a［31]、miR-200［32]等）的表達(dá)，因此本研究初步構(gòu)成的5 個“TF-miRNA”反饋環(huán)可能在腦梗死疾病中發(fā)揮作用。同時研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧環(huán)境下，KLF4 可上調(diào)VEGF 的水平［33]，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）增殖、遷移和管形成。Zhou 等［34]研究發(fā)現(xiàn)沉默eEF2K 可以有效降低KLF5 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白水平，降低與VEGF 啟動子結(jié)合的KLF5 的水平，導(dǎo)致VEGF mRNA 表達(dá)下降，抑制血管新生。因此，以KLF4、KLF5 為轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的反饋環(huán)可轉(zhuǎn)錄上調(diào)VEGF 分子，激活VEGF 信號通路，在腦梗死后血管新生中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

榮氣是一切精微物質(zhì)的總稱［5]，榮氣氣化［35]是“精化氣→氣生變→變成形”的過程，可促進(jìn)腦梗死后血管再生。本團(tuán)隊首次提出缺血中風(fēng)辨治理論體系——“榮氣虛滯”，并創(chuàng)立活血榮絡(luò)法，制定了活血榮絡(luò)方，在臨床中頗有療效。前期研究證實活血榮絡(luò)方［11，13]以常規(guī)劑量干預(yù)腦梗死大鼠7 d具有較好的促腦梗死血管新生的作用，因此本研究采用腦梗死大鼠模型，進(jìn)一步驗證構(gòu)成的“TF-miRNA”反饋環(huán)可能在腦梗死疾病中發(fā)揮作用，并驗證該保護(hù)作用可能與此反饋機(jī)制介導(dǎo)的血管新生有關(guān)。

本研究表明，活血榮絡(luò)方與丁苯酞可改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損，且具有時間依賴性；HE、Nissl 染色結(jié)果顯示藥物干預(yù)下神經(jīng)元損傷及水腫減輕，細(xì)胞間隙縮小，尼氏小體數(shù)目增加，表明活血榮絡(luò)方與丁苯酞均能對腦梗死大鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用；RT-PCR 結(jié)果顯示，腦梗死大鼠腦組織中KLF4、KLF5、VEGF 與miR-206、miR-429 表達(dá)均升高，同時活血榮絡(luò)方與丁苯酞能進(jìn)一步升高腦梗死大鼠腦組織中KLF4、KLF5、VEGF 表達(dá)，而降低miR-206、miR-429 表達(dá)，結(jié)合反饋環(huán)模式，可認(rèn)為活血榮絡(luò)方與丁苯酞可能下調(diào)miR-206、miR-429，上調(diào)KLF4、KLF5，影響腦梗死中存在的“KLF4-miR-206”“KLF4-miR-429”“KLF5-miR-429”負(fù)反饋環(huán)，進(jìn)而上調(diào)VEGF，促腦梗死后血管新生，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。VEGF［36]能促進(jìn)ECs 增殖、遷移、分化，介導(dǎo)三級側(cè)支循環(huán)血管新生，改善腦梗死后局部血供，代償性營養(yǎng)神經(jīng)元。Zhou 等［37]采用同步輻射血管造影（SRA）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)丁苯酞干預(yù) 7、14 d，能上調(diào) VEGF、VEGFR2、CD31 等血管新生蛋白表達(dá)，增加腦梗死大鼠血流灌注及血管密度，促進(jìn)腦梗死后血管新生。因此活血榮絡(luò)方與丁苯酞均能上調(diào)TFs（KLF4、KLF5）、下調(diào)miRNAs（miR-206、miR-429）的表達(dá)，打破腦梗死大鼠中存在的“TFmiRNA”反饋環(huán)，介導(dǎo)ECs 中VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)腦梗死后血管新生。

綜上所述，活血榮絡(luò)方能抑制miRNA（miR-206、miR-429 等）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中特定的TF（KLF4、KLF5 等）的表達(dá)，打破特定“TFmiRNA”反饋環(huán)，促進(jìn)VEGF 分子表達(dá)，可能在腦梗死后神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮作用；同時為研究中成藥/中醫(yī)藥提供新的研究方向或是思路。