丁酸梭菌早期干預對大腸桿菌攻毒肉仔雞腸道菌群和短鏈脂肪酸的影響

■舒均蘭 徐 娥* 桂國弘 肖明飛 肖英平 唐青松

（1.貴州大學動物科學學院，動物營養(yǎng)與飼料研究所，貴州貴陽550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴州貴陽551400；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江杭州310021）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）極易引起初生畜禽腹瀉、腸道疾病甚至死亡，一直以來是制約畜禽健康高效養(yǎng)殖的重大因素。以往常用抗生素治療或控制大腸桿菌引起的負面影響，近年隨著抗生素耐藥性和殘留問題的日益凸顯，全球限制了抗生素在畜禽業(yè)上的使用。丁酸梭菌是益生菌中重要一員，近年普遍研究表明，丁酸梭菌具有顯著的抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強免疫力等生物學功能[1-5]。此外，丁酸梭菌還可促進機體短鏈脂肪酸、乳酸和消化酶等物質(zhì)生成，并且通過調(diào)節(jié)腸道菌群、促進免疫防御因子分泌來改善畜禽健康[6]。Yang等[7]研究表明，在飼糧中添加丁酸梭菌可降低肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，提高肉雞盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。申露露等[8]研究表明，丁酸梭菌早期干預可降低大腸桿菌攻毒肉雞腸道炎癥因子和抗菌肽基因的表達，并降低了雛雞的下痢。Zhang等[2]研究表明，飼糧添加丁酸梭菌可改善大腸桿菌攻毒肉雞的生長性能、腸屏障功能和消化酶活性。然而，丁酸梭菌早期干預對大腸桿菌感染肉雞的腸道短鏈脂肪酸含量的影響還未見相關報道，早期干預對腸道菌群的研究也較少。因此，本試驗研究了丁酸梭菌對肉仔雞大腸桿菌感染攻毒后腸道短鏈脂肪酸含量和菌群結構的變化，以期為肉雞乃至家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中丁酸梭菌防治大腸桿菌病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與菌種

試驗1日齡肉仔雞為ROSS 308肉雞，購至江蘇鎮(zhèn)江騰達孵化廠。試驗用丁酸梭菌（編號：MIYAIRI II 588）購于日本米雅利桑株式會社。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88（編號：CVCC1556）購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗設計

試驗選取200只健康狀況良好的1日齡ROSS308肉仔雞，根據(jù)體重無差異原則隨機分為2組，每組100只雞，分別為對照組（Control組）和丁酸梭菌組（CB組）。試驗開始后1～3 d，每天對Control組的仔雞灌喂1 mL生理鹽水，CB組仔雞灌喂1 mL濃度為109CFU/mL的丁酸梭菌菌液，在第7 d時把CB組再隨機分為丁酸梭菌組（CB組）和丁酸梭菌+大腸桿菌組（CB+EC組），同時將Control組也隨機分成對照組（Control）和大腸桿菌組（EC組），每組50只仔雞。EC組和CB+EC組7日齡至試驗結束每天對仔雞灌喂1 mL濃度為108CFU/mL的大腸桿菌菌液，Control組和CB組7日齡至試驗結束每天對仔雞灌喂1 mL生理鹽水，試驗期為14 d。試驗設計和分組情況如表1所示。

表1 試驗處理情況

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗地點為浙江省農(nóng)業(yè)科學院動物試驗基地。試驗開始前對動物房舍、飼養(yǎng)設備進行檢查和嚴格的消毒處理，動物房室內(nèi)的溫度利用白熾燈調(diào)節(jié)，第一周溫度保持在37℃，之后每周逐漸降低2～3℃，直到與室溫一致，保持24 h光照。試驗肉仔雞自由采食和自由飲水，人工投料，每天投喂3次?；A日糧組成及其營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎，%）

1.4 樣品采集和保存

在肉仔雞的10、14日齡時，每組隨機抽取8只肉仔雞進行屠宰，分別收集回腸和盲腸中段內(nèi)容物于5 mL離心管，液氮保存，采樣完畢后保存至-80℃超低溫冰箱用于提取細菌DNA。

1.5 短鏈脂肪酸的測定

稱取0.1 g的盲腸內(nèi)容物于離心管中，加入9倍體積（mL）的PBS溶液混合均勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液500μL，加入100μL的25%（質(zhì)量體積比）偏磷酸巴豆酸混合液，渦旋混勻，于-20℃冰箱過夜保存24 h。上機前，12 000 r/min離心10 min取上清液于0.22μm濾膜過濾，取150μL于進樣瓶，于氣相色譜儀測定SCFAs含量。色譜條件為：色譜柱溫度70℃；使用FID1檢測器；檢測溫度250℃；載氣為氮氣；壓力為37.5 kPa；氧氣壓力50 kPa，氫氣50 kPa，靈敏度為10-1，衰減3.0。

1.6 糞便DNA提取和高通量測序分析

糞便DNA參照QIAGEN公司（QIAGEN，German）試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit的操作步驟進行提取。并以提取的DNA為模板，引物為338F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對細菌16SrRNA基因V3～V4區(qū)進行PCR擴增。采用雙端測序法（Pair end,250 bp×2），Hiseq2500平臺進行PE250測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Uparse軟件（Uparse V7.0.1001）依據(jù)相似性≥97%將質(zhì)控后的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。采用QIIME（Version 1.7.0）默認參數(shù)計算各樣品的alpha多樣性指數(shù)（包括菌群豐度指數(shù)Ace和Chao分析，菌群多樣性香農(nóng)指數(shù)Shannon和辛普森指數(shù)Simpson分析以及覆蓋度指數(shù)Good coverage分析）和物種分布。為了比較使用BPW增菌劑增菌不同時間的菌群結構差異，使用R軟件（Version 2.15.3）內(nèi)的FactoMineR軟件包對樣品之間的菌群結構相似度進行主坐標分析（PCoA）。短鏈脂肪酸和腸道菌群相對豐度的結果均使用SPSS分析，SPSS 18.0分析實驗數(shù)據(jù)的顯著性。結果以“平均值±標準誤（Mean±SEM）”表示，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 回腸與盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸的含量

從表3可知，在肉雞第10日齡（攻毒3 d后）和第14日齡（攻毒7 d后）的回腸中，其短鏈脂肪酸的含量非常少，各組間均差異不顯著（P＞0.05）。

表3 丁酸梭菌對肉雞不同天數(shù)回腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響(mg/g)

由表4可知，在肉仔雞盲腸中，10日齡時，與Control組相比，CB組中乙酸含量極顯著提高（P＜0.01），EC組中的乙酸含量顯著降低（P＜0.05）；CB組和CB+EC組中丁酸的含量較為相近，均極顯著高于Control組和EC組（P＜0.01）。14日齡時，與Control組相比，CB組中的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸含量均顯著提高（P＜0.05），EC組中的乙酸、丙酸、丁酸顯著降低（P＜0.05）。

表4 丁酸梭菌對肉雞不同天數(shù)盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響(mg/g)

2.2 盲腸內(nèi)容物細菌高通量測序

試驗第10日齡和14日齡肉仔雞盲腸菌群結構的測定使用高通量測序技術，結果如表5所示，第10日齡和、第14日齡肉仔雞各組分別平均獲得371～405、375～651個OUT，各樣品覆蓋度指數(shù)（good coverage）在0.998以上。結果表明，已基本全部測出樣品中序列。并且通過作出稀釋性曲線圖觀察，如圖1所示，所有樣品的測序曲線趨向平坦，可說明此次測序量結果合理，并得出測序深度為63 390次。

圖1 稀釋曲線

表5 不同天數(shù)各組盲腸內(nèi)容物16S rRNA測序結果

如圖2所示，肉仔雞盲腸第10日齡時各組均以厚壁菌門（Fimicutes）為主要門類，相對豐度占比均在90%以上，其次為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）柔壁菌門（Tenericutes）。如圖3為10日齡肉雞盲腸屬水平相對豐度，各組主要以乳酸菌屬、毛螺菌科、瘤胃球菌屬、丁酸球菌屬、魏斯氏菌屬（Weissella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等為主要菌群。

圖2 第10日齡肉雞盲腸內(nèi)容物菌群結構（在門水平上）

圖3 第10日齡肉雞盲腸內(nèi)容物菌群結構（在屬水平上）

肉仔雞14日齡時，各組的菌群結構發(fā)生了變化，在門水平上（見圖4），在各組主要以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門以及藍藻門（Cynaobacteria）為主。在屬水平上，由圖5顯示的各菌屬占比可知，乳酸菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺菌科、瘤胃球菌科、柔嫩梭菌屬（Faecalibacterium）、丁酸球菌屬、芽孢桿菌屬等為其主要的菌屬。

圖4 第14日齡肉雞盲腸內(nèi)容物菌群結構（在門水平上）

圖5 第14日齡肉雞盲腸內(nèi)容物菌群結構（在屬水平上）

表6為肉仔雞10、14日齡時各組在屬水平上，排名前八的菌群相對豐度，各組中相對豐度較大的菌屬均差異不顯著（P＞0.05）。在10日齡時，相對較多的為乳酸菌屬、毛螺菌科、丁酸球菌屬以及瘤胃球菌屬4種菌屬，其中CB組中瘤胃球菌屬的相對豐度顯著高于其他各組（P＜0.05）。14日齡時相對豐度較多的屬為乳酸菌屬、毛螺菌科、瘤胃球菌屬以及瘤胃球菌科4種屬，但均差異不顯著（P＞0.05）。

表6 不同天數(shù)屬水平菌群結構相對豐度（%）

圖6和圖7為主坐標分析（PCoA）圖，利用主坐標分析這種方法，可以觀察各組樣品相對豐度的相似性或差異性。從圖6可以看出，肉仔雞10日齡時對Control組與其他各試驗組相比，其相似性有較大差異。同時從圖7可以看出，肉仔雞14日齡時Control組、CB+EC組和另兩個組相似性較小。

圖6 不同樣品10日齡PCoA分析

圖7 不同樣品14日齡PCoA分析

3 討論

3.1 丁酸梭菌對肉雞腸道短鏈脂肪酸含量的影響

腸道是動物機體最大的免疫器官，也是營養(yǎng)物資消化吸收的主要場所，腸道健康程度很大程度上決定了動物的生長性能和整體健康狀況。短鏈脂肪酸是微生物代謝的一類主要產(chǎn)物，也稱揮發(fā)性脂肪酸，主要由碳鏈中碳原子數(shù)小于6的乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異戊酸等組成[9]。研究表明，短鏈脂肪酸具有供能、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、維持腸道穩(wěn)態(tài)和改善腸道菌群等重要作用[10-12]。丁酸梭菌通過在腸道中發(fā)酵纖維產(chǎn)生的短鏈脂肪酸丁酸，是機體結腸上皮細胞的主要能量物質(zhì)，并通過氧化為細胞供能，增強腸道免疫和屏障功能。丁酸的代謝產(chǎn)物可以提高腸道對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，補充機體所需的營養(yǎng)素[13-14]。郭傳珍等[15]在飼糧中添加不同劑量的丁酸鈉，可增加肉仔雞腸道短鏈脂肪酸濃度。這與本試驗相似，本試驗中直接使用現(xiàn)配制的含有丁酸梭菌活菌的培養(yǎng)液，在腸道厭氧的環(huán)境下繼續(xù)發(fā)酵增殖，代謝產(chǎn)生丁酸，檢測結果顯示出灌喂丁酸梭菌提高了盲腸乙酸、丁酸、異丁酸的含量，并且隨著灌喂的時間推遲，呈現(xiàn)出盲腸短鏈脂肪酸增加的趨勢。此外，大腸桿菌會導致乙酸含量降低，這提示丁酸梭菌一定程度上可抑制大腸桿菌降低盲腸短鏈脂肪酸含量。

3.2 丁酸梭菌對肉雞腸道菌群結構的影響

丁酸梭菌是一類重要的益生菌，進入動物腸道可促進腸道有益菌的生長，抑制有害菌的增殖[16]。腸道菌群為動物宿主提供額外的代謝功能，包括營養(yǎng)的消化吸收、膳食纖維的發(fā)酵利用和某些微生物的合成等。腸道菌群與家禽生長發(fā)育密切相關，并參與腸道免疫調(diào)控[17]。劉亭婷等[18]研究表明丁酸梭菌促進蛋用仔公雞乳酸桿菌和雙歧桿菌等的益生菌的增殖，并抑制大腸桿菌的生長。Yang等[7]研究表明，丁酸梭菌有益于肉雞腸道菌群的平衡。Zhang[1]等報道，丁酸梭菌降低了大腸桿菌K88攻毒肉雞盲腸大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的數(shù)量，并提高了雙歧桿菌數(shù)量，改善了腸道微生物區(qū)系。Huang等[19]研究表明，飼糧添加丁酸梭菌，降低了壞死性腸炎的東北雞腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌的豐度。此外，多方研究報道了丁酸梭菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[20-23]。本試驗通過細菌高通量測序發(fā)現(xiàn)，肉仔雞盲腸主要以厚壁菌門、變型菌門和擬桿菌門為主，這與前人[24]研究結果一致。在屬水平上，各組間均以乳酸菌屬、毛螺菌科、瘤胃球菌屬、瘤胃球菌科、丁酸球菌屬等為其優(yōu)勢菌群，其中灌胃了丁酸梭菌的肉仔雞試驗組中瘤胃球菌屬的相對豐度顯著增加，乳酸菌屬的相對豐度仍然保持著較高的水平。有研究表明，瘤胃球菌科能夠產(chǎn)生碳水化合物降解酶，其中瘤胃球菌屬能夠分泌大量的纖維素酶和半纖維素酶，混合發(fā)酵產(chǎn)生乙酸；毛螺菌科中的多個菌屬能夠發(fā)酵纖維代謝產(chǎn)生丁酸[25-26]。以此為腸道提供濃度較高的酸環(huán)境，降低腸道pH，改善腸道結構。結果提示，丁酸梭菌早期干預可改善大腸桿菌攻毒肉雞的腸道菌群結構。

4 結論

綜上所述，丁酸梭菌早期干預和大腸桿菌攻毒肉仔雞，能夠提高肉仔雞盲腸內(nèi)乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸的含量。同時在一定程度上能夠抑制肉仔雞腸道中大腸桿菌增殖，提高乳酸菌等有益菌的數(shù)量，以此緩解大腸桿菌攻毒的負面影響。這為丁酸梭菌作為新型飼料添加劑在肉雞實際生產(chǎn)中的應用提供了理論依據(jù)。