MTHFR 基因C677T 及A1298C 多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸水平在復發(fā)性流產中的相關性研究

趙 愛 張 麗 孟 琳

1.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院產科，江蘇淮安 223300；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產科，江蘇徐州 221000

復發(fā)性流產被定義為兩個或多個連續(xù)妊娠失敗，影響1%～3%育齡婦女[1-4]。亞甲基四氫葉酸還原酶在葉酸代謝中起著至關重要的作用[5-7]。研究認為，MTHFR基因突變可導致葉酸代謝和轉運異常，從而導致妊娠失敗，是復發(fā)性流產發(fā)病的重要原因之一[8-10]。同型半胱氨酸水平異常是血液高凝狀態(tài)的重要因素，同型半胱氨酸水平增加可導致血液高凝，是復發(fā)性流產的重要病因[11]。MTHFR 酶在葉酸、高半胱氨酸的代謝中起著核心作用[12-13]。本研究旨在觀察MTHFR 基因C677T及A1298C 多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸在復發(fā)性流產中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年12 月—2019 年6 月江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院收治的復發(fā)性流產女性100 例為復發(fā)性流產組。選取標準：①年齡>20 歲且<40 歲；②診斷標準符合皇家婦產科學院（RCOG）中不明原因復發(fā)性流產指南[14]；③簽署知情同意書；④流產次數≥2 次。排除標準：①夫妻雙方染色體核型異常；②抗磷脂抗體陽性；③多胎妊娠；④宮頸功能不全、輔助生殖技術妊娠、輸卵管疾病、生殖器器質性病變、先兆子癇史、系統(tǒng)性自身免疫疾病；⑤神經精神疾病、吸煙史、糖尿病、骨質疏松、甲狀腺功能異常、腫瘤、肝功能障礙；⑥近期服用葉酸、維生素B12、維生素B6、核黃素等；⑦因胎兒染色體異常引起的流產。選取同期100 名有1 次生育史但無不良孕產史女性作為對照組。

復發(fā)性流產組年齡21～39 歲，平均（33.1±3.3）歲；盆腔手術史15 例；體重指數（2.34±0.81）kg/m2。對照組年齡21～38 歲，平均（33.3±3.4）歲；盆腔手術史16 例；體重指數（2.36±0.82）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P >0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》中道德準則。

1.2 方法

1.2.1 MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型檢測抽取約3 mL 靜脈血，置于EDTA 試管，使用DNA 提取試劑盒（貝克曼AMPure XPdna 提取試劑盒，貨號：A63880）提取總DNA。限制性片段長度多態(tài)性用于檢測基因型。PCR 反應體系以23 μL 反應進行，含有0.25 μL Taq DNA 聚合酶混合物、0.2 μL dNTP、引物0.25 μL 1×Taq 緩沖液、1.5 μL MgCl2、2 μL 基因組DNA。PCR 反應在35℃下進行，共35 個循環(huán)，反應條件：95℃變性1 min，65℃退火30 s，72℃擴展1 min，延伸周期72℃5 min。C677T 引物序列：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’（正向引物）、5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’（反向引物）。A1298C引物序列：5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’（正向引物）和5’-CACTTTGTGACCGTTCCGGTTTG-3’（反向引物）。使用DNA 測序儀（德國Roche 公司）進行基因型檢測[15]。

1.2.2 血漿同型半胱氨酸檢測 抽取約3 mL 靜脈血，置于EDTA 試管，靜置30 min 后3000 r/min 離心8～10 min（離心半徑15 cm），取上清液，使用比色法測定同型半胱氨酸水平，試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，貨號：YBE031。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。使用Genemapping v.4.2 軟件評估基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡標準；復發(fā)性流產發(fā)生風險與基因型的關系采用logistic 回歸分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型分布

MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型頻數分布均符合Hardy-Weinberg 定律（對照組：C677T χ2=0.694，P=0.405；A1298C χ2=0.146，P=0.702。觀察組：C677T χ2=0.588，P=0.443；A1298C χ2=0.634，P=0.426）。兩組C677T 和A1298C 基因型比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），見表1。

表1 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型分布[例（%）]

2.2 不同基因型復發(fā)性流產的發(fā)生風險

以復發(fā)性流產為因變量，以MTHFR 基因C677T和A1298C 基因型為自變量，賦值如下：C677T（CC=0，CT=1，TT=2）；A1298C（AA=0，AC=1，CC=2）。與C677T CC 型比較，C677T TT 型發(fā)生復發(fā)性流產的風險增加3.357 倍（P=0.008）；與A1298C AA 型，A1298C CC 型發(fā)生復發(fā)性流產的風險增加3.721 倍（P=0.012）。見表2。

表2 MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型復發(fā)性流產發(fā)生風險

2.2 兩組血漿同型半胱氨酸水平比較

復發(fā)性流產組同型半胱氨酸水平為（8.98±2.11）μmol/L，高于對照組的（7.18±1.65）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.720，P ＜0.001）。

2.3 復發(fā)性流產組不同基因型患者血漿同型半胱氨酸水平比較

C677T TT 型同型半胱氨酸水平高于C677T CC 型和C677T CT 型，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；A1298C CC 同型半胱氨酸水平高于A1298C AA 型和A1298C AC 型，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見表3。

表3 復發(fā)性流產組不同基因型患者血漿同型半胱氨酸水平比較

3 討論

MTHFR 基因多態(tài)性已被證實與流產有顯著相關性[16-19]，其中C677T 和A1298C 位點的研究較多[20]，既往研究證實，在不同國家和地區(qū)C677T TT 型和A1298C CC 型女性復發(fā)性流產風險增高[21-23]。本研究結果顯示，復發(fā)性流產女性C677T TT 型和A1298C CC 型占比高于對照組。與C677T CC 型比較，C677T TT 型發(fā)生復發(fā)性流產的風險增加3.357 倍（P=0.008）；與A1298C AA 型，A1298C CC 型發(fā)生復發(fā)性流產的風險增加3.721 倍（P=0.012）。該結果證實MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點的多態(tài)性對復發(fā)性流產的發(fā)病風險造成影響，其中C677T TT 型和A1298C CC型女性復發(fā)性流產的發(fā)病風險顯著增高。

高同型半胱氨酸血癥導致流產的機制仍不清楚。高同型半胱氨酸血癥可能通過損傷內皮細胞、激活血小板等誘導凝血而引發(fā)血栓形成，另一種機制可能是通過置換內皮細胞以及調節(jié)和產生單核細胞趨化蛋白-1 和白細胞介素-8 引起血管舒張，還有研究認為其可通過氧化應激直接對胚胎產生毒性作用[15,19]。王連等[15]研究認為，高同型半胱氨酸血癥是復發(fā)性流產的重要危險因素。MTHFR C677T 和A1298C 多態(tài)性、高同型半胱氨酸血癥和反復流產之間的關聯仍不清楚。本研究結果顯示，C677T TT 型同型半胱氨酸水平高于CC 型和CT 型；A1298C CC 型同型半胱氨酸水平高于AA 型和AC 型（均P ＜0.05）。提示C677T TT型、A1298C CC 型等位基因會增加同型半胱氨酸水平。Zaric 等[24]研究顯示，MTHFR 活性降低與高半胱氨酸水平顯著相關。C677T 和A1298C 突變可導致MTHFR酶活性受到抑制，使5-甲基四氫葉酸生成減少，因此5-甲基四氫葉酸與半胱氨酸生成蛋氨酸和四氫葉酸減少，從而導致核酸代謝障礙，胎兒生長發(fā)育受到抑制[25]。

綜上，MTHFR 基因C677T TT 型、A1298C CC 型復發(fā)性流產發(fā)生風險增高，且C677T 及A1298C 多態(tài)性可導致同型半胱氨酸水平升高。MTHFR 基因C677T 及A1298C 突變可能通過改變酶活性增高同型半胱氨酸水平，參與復發(fā)性流產發(fā)病。