下丘腦內(nèi)側(cè)基底部神經(jīng)元HIF1α 缺失對(duì)小鼠體重和糖代謝的影響

艾孜買提·肉孜江 單瑋碧 郭 海 姚巧玲

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，新疆烏魯木齊 830011

肥胖癥是指各種疾病引起的能量攝入超過能量消耗導(dǎo)致體重、體脂含量增加的代謝性疾病，會(huì)增加多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-5]。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）是細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)，并參與各種適應(yīng)性反應(yīng)的一種核轉(zhuǎn)錄因子[6-8]，下丘腦弓狀核或促黑素（pro-opiomelanocortin，POMC）神經(jīng)元中的HIF 可能在高脂飼料喂養(yǎng)下或老年?duì)顟B(tài)下參與小鼠食欲及體重的平衡調(diào)節(jié)[9-11]。HIF 對(duì)體重調(diào)控是否僅在高脂飼料或老年?duì)顟B(tài)下存在，目前尚不清楚。

因此，本研究擬敲除缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF1α）flox/flox小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)基底部（mediobasal hypothalamus，MBH）神經(jīng)元中的HIF1α，探究MBH 神經(jīng)元中HIF1α 在小鼠體重和糖代謝中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和整體設(shè)計(jì)

選用30 只HIF1αflox/flox雄鼠（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（新）2018-0002），周齡6～8 周，體重23 g左右。將體重相近的兩只小鼠隨機(jī)分在兩組，兩組小鼠平均體重相差不大于2 g，每組15 只。均在注射后第5 天起每天19:30 稱量體重和進(jìn)食量。

1.2 病毒注射

實(shí)驗(yàn)組小鼠MBH 注射cre 腺相關(guān)病毒AAVhSyn-cre-GFP，選擇性敲除MBH 神經(jīng)元中的HIF1α；對(duì)照組小鼠注射AAV-hSyn-GFP。兩組注射部位均為下丘腦內(nèi)側(cè)基底部神經(jīng)元[前囟-1.5，中線±0.5（兩側(cè)），背腹5.8（顱骨表面）]。注射濃度均為1.45E+13 v.g./mL的病毒0.5 μL（上海吉?jiǎng)P基因，GCPV0181762）。

1.3 制作冰凍切片觀察病毒注射的位置及表達(dá)情況

病毒注射28 d 后，每組隨機(jī)選取3 只小鼠經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛5 min 后取腦組織，分別在4%多聚甲醛和20%的蔗糖溶液4℃中放置24 h，用2-Methylbutane速凍（SIGMA-ALDRICH STBH3448）并存于-80℃。用O.C.T.Compound 固定于冰凍切片機(jī)（Leica，CM1860）做30 μm 切片并貼片，在熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B）下觀察并拍片。

1.4 試劑盒分析

病毒注射28 d 后，選取剩余12 只小鼠，使用葡萄糖比色法測(cè)試盒（Elabscience，E-BC-K268）檢測(cè)血清中葡萄糖含量；使用Mouse Insulin ELISA Kit（Raybio，ELM-Insulin）檢測(cè)血清胰島素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MBH 神經(jīng)元HIF1α 的缺失對(duì)小鼠體重和進(jìn)食量的影響

整體分析小鼠體重發(fā)現(xiàn)，組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；提示病毒注射后隨著時(shí)間變化，兩組小鼠體重差異越來越明顯。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：兩組小鼠第15、25、28 天的體重均高于第5 天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；組間比較：實(shí)驗(yàn)組第15、25、28 天的體重高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

整體分析小鼠進(jìn)食量發(fā)現(xiàn)，組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；提示病毒注射后隨著時(shí)間變化，兩組小鼠進(jìn)食量差異越來越明顯。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：對(duì)照組第15、25、28 天與第5 天進(jìn)食量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），實(shí)驗(yàn)組第15、25、28 天的進(jìn)食量均高于第5 天；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；組間比較：實(shí)驗(yàn)組第15、25、28 天的進(jìn)食量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 MBH 神經(jīng)元HIF1α 的缺失對(duì)小鼠體重和進(jìn)食量的影響（g，±s）

表1 MBH 神經(jīng)元HIF1α 的缺失對(duì)小鼠體重和進(jìn)食量的影響（g，±s）

注：與本組第5 天比較，*P ＜0.05；與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)比較，△P ＜0.05。MBH：下丘腦內(nèi)側(cè)基底部；HIF1α：缺氧誘導(dǎo)因子1α

2.2 病毒在下丘腦神經(jīng)元的定位及表達(dá)

圖1A 中綠色熒光區(qū)域是下丘腦AAV-hSyn-GFP 的表達(dá)位置；圖1B 中綠色熒光是下丘腦AAVhSynGFP-cre 的表達(dá)位置。

圖1 病毒注射及表達(dá)位置

2.3 MBH 注射AAV-hSyn-GFP 和AAV-hSyn-cre-GFP后HIF1αflox/flox 小鼠血糖、胰島素含量變化及相關(guān)性分析

兩組小鼠空腹血糖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2A。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的胰島素水平升高，達(dá)到（62.17±15.37）μIU/mL，是對(duì)照組的3.5 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見圖2B。分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清胰島素水平與體重呈正相關(guān)（r=0.660，P ＜0.05），見圖2C。

圖2 MBH 注射AAV-hSyn-GFP 和AAV-hSyn-cre-GFP 后HIF1αflox/flox 小鼠血糖、胰島素含量變化及相關(guān)性分析

3 討論

下丘腦是調(diào)節(jié)能量代謝的基本中樞[12-15]，可以感知生物代謝動(dòng)態(tài)的信號(hào)并作出調(diào)節(jié)[16-18]。在食源性肥胖中，全身的能量穩(wěn)態(tài)遭到破壞[19-21]。敲除小鼠下丘腦POMC 神經(jīng)元中的HIF 或弓狀核的HIF-1β，正常飲食下未發(fā)現(xiàn)小鼠進(jìn)食量和體重變化，但高脂飲食下兩者明顯增加[8]。本研究條件性敲除MBH 神經(jīng)元HIF1α，正常飲食下小鼠的體重及進(jìn)食量顯著增加，提示下丘腦POMC 神經(jīng)元和弓狀核區(qū)域以外的神經(jīng)元HIF1α可能也參與體重平衡調(diào)節(jié)。體重增加早于進(jìn)食量增加發(fā)生，提示MBH 神經(jīng)元HIF1α 不僅影響小鼠食欲，還可能影響小鼠的能量代謝率。

研究發(fā)現(xiàn)HIF 誘導(dǎo)可以增強(qiáng)下丘腦葡萄糖感應(yīng)[22]，抑制下丘腦HIF 會(huì)導(dǎo)致葡萄糖耐受不良與血清胰島素水平升高[10,23-25]。本研究中，MBH 神經(jīng)元HIF1α 的缺失導(dǎo)致小鼠血清中胰島素含量顯著增加，說明小鼠發(fā)生了胰島素抵抗——其血糖水平的正常是更多胰島素分泌的結(jié)果。相關(guān)性分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠胰島素與體重的變化呈正相關(guān)，此時(shí)出現(xiàn)的胰島素分泌增加可能是小鼠體重增加導(dǎo)致的繼發(fā)后果。MBH 神經(jīng)元HIF1α 的缺失導(dǎo)致下丘腦對(duì)葡萄糖敏感性降低可能是小鼠食欲增加的主要原因。后續(xù)將進(jìn)一步研究MBH 神經(jīng)元HIF1α 缺失對(duì)下丘腦葡萄糖感應(yīng)、胰島素信號(hào)通路和血脂調(diào)控通路的影響及機(jī)制，進(jìn)一步了解MBH 神經(jīng)元HIF1α 如何影響食欲和能量代謝水平。