核磁共振磷譜定量測(cè)定肉制品中磷酸鹽的含量

韓 智，江 豐，周 密，張亞珍，龔 蕾，王會(huì)霞

(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430075)

多聚磷酸鹽是肉制品加工中常用的品質(zhì)改良劑，有助于提高肉制品的保水性及嫩度，具有殺菌及抗氧化作用[1]。然而過(guò)量攝入磷酸鹽可能會(huì)危害人體健康，有研究表明動(dòng)物(大鼠)攝入過(guò)量磷酸鹽會(huì)增加其患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前我國(guó)批準(zhǔn)使用的磷酸鹽食品添加劑共有18種[3]，在肉制品中廣泛使用的有三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽、焦磷酸鹽，三者通常按照不同比例混合使用[4]?！妒称诽砑觿┦褂脴?biāo)準(zhǔn)》規(guī)定在預(yù)制肉制品、熟肉制品、冷凍魚糜制品(包括魚丸等)中磷酸鹽最大使用量為5.0 g/kg(單獨(dú)或混合使用，以PO43-計(jì))[3]。

目前有關(guān)磷酸鹽的國(guó)家及行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有薄層層析法、鉬藍(lán)分光光度法、釩鉬黃分光光度法及離子色譜法[5-8]。文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法還有流動(dòng)注射分析(FIA)結(jié)合分光光度法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、快檢試劑盒法[11]。然而，使用分光光度法時(shí)，需要通過(guò)消解將磷酸鹽全部轉(zhuǎn)換成正磷酸鹽再進(jìn)行測(cè)定，無(wú)論通過(guò)濕法消解、干法灰化還是亞硫酸鈉還原，都無(wú)法測(cè)定除正磷酸鹽離子之外的其它種類離子。離子色譜法易受基質(zhì)干擾影響，且需要經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟提取及凈化，耗費(fèi)大量時(shí)間和試劑耗材，分析方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，易受其它陰離子影響。毛細(xì)管電泳方法易受到緩沖液溶度、pH、分離電壓、溫度等各方面因素影響，遷移時(shí)間重現(xiàn)性較差?？鞕z試劑盒法雖不需要大型儀器，但其耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確度低。

近年來(lái), 隨著核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance，NMR)的發(fā)展，越來(lái)越多的科研工作者使用NMR來(lái)進(jìn)行目標(biāo)化合物的定性及定量[12-13]。在NMR定性定量研究中，1H-NMR譜應(yīng)用最為廣泛，其次是13C- NMR，31P-NMR應(yīng)用較少，但是由于一般食品基質(zhì)中含有31P原子的比例遠(yuǎn)小于1H，對(duì)于不含P原子的物質(zhì)，基本不存在基質(zhì)效應(yīng)，因此31P -NMR在定性和定量方面，相比于1H-NMR和13C-NMR具有很大的優(yōu)勢(shì)[14]。

31P-NMR在食品分析中的應(yīng)用廣泛，包括橄欖油等級(jí)鑒定、畜禽肉新鮮度鑒別、牛奶中甘油磷酰膽堿定量測(cè)定、酪蛋白中磷脂酰絲氨酸定量測(cè)定、淀粉來(lái)源辨別、果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥定量測(cè)定等[15-18]。Stanley等[19]對(duì)市售的三聚磷酸鈉進(jìn)行31P-NMR分析，鑒別出市售三聚磷酸鈉中含有焦磷酸鈉、三偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉3種雜質(zhì)，并定量測(cè)定其含量。Stanislawski等[20]使用31P-NMR定量測(cè)定三偏磷酸鈉、四偏磷酸鈉、磷酸氫二鈉、焦磷酸鈉，采集時(shí)間2 h，檢出限為200 mg/kg；說(shuō)明31P-NMR可用于磷酸鹽的定量研究。

本研究詳細(xì)討論使用31P-NMR定量檢測(cè)肉制品中磷酸鹽的影響因素，選取六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphoramide, HMPA)為內(nèi)標(biāo)的方法定量測(cè)定肉制品中磷酸鹽。本方法旨在提供一種簡(jiǎn)便且不需要消耗有機(jī)試劑，不需復(fù)雜的提取及凈化等前處理過(guò)程，可在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品情況下快速定性定量測(cè)定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽含量的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

重 水 美 國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司；HMPA 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；三偏磷酸根、三聚磷酸根、磷酸根、焦磷酸根 濃度均為1000 mg/L，美國(guó)O2si公司；三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉、磷酸鉀、焦磷酸鈉 純度≥98.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鉀、氫氧化鈉 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Bruker Avance III HD 600 MHz波譜儀配備PABBO 600S3 BBF-H-D-05 Z SP探頭 德國(guó)布魯克公司；核磁管 5 mm，美國(guó)Norell公司；ICS-5000+型離子色譜儀 美國(guó)賽默飛世爾公司；230Volt型渦旋振蕩器 美國(guó)Talboys公司；S210型酸度計(jì) 美國(guó)梅特勒-托利多公司；S 180H超聲波清洗儀(功率為1000 W) 德國(guó)艾爾瑪公司；Milli-Q型超純水機(jī) 法國(guó)密理博公司；GM200型刀式研磨儀 德國(guó)萊馳公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核磁共振方法

1.2.1.1 堿性緩沖鹽配制 試劑1：硼酸-氯化鉀緩沖液(pH=9.0)。取硼酸3.09 g，用0.1 mol/L氯化鉀溶液500 mL溶解，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液210 mL。

試劑2：0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉。取29.224 g EDTA，加超純水900 mL，用10 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到9.0，使其完全溶解，再定容到1 L。

堿性緩沖鹽：試劑1/試劑2(2/1，V/V)。

1.2.1.2 樣品前處理 參照文獻(xiàn)方法[21-22]并加以修改，取肉制品約100 g，切成約1 cm3的肉丁，用刀式研磨儀絞碎。稱取約5.00 g絞碎的樣品，加入堿性緩沖鹽10 mL，渦旋振蕩2 min，4 ℃下12000 r/min離心5 min，倒出上清液；用10 mL提取液重復(fù)提取并離心一次，合并兩次上清液，轉(zhuǎn)移到25 mL具塞比色管中，加入200 μL濃度為100 mg/mL的HMPA內(nèi)標(biāo)溶液，用堿性緩沖鹽定容到25 mL，取2～3 mL上清液過(guò)0.45 μm濾膜，為待測(cè)液。用移液槍精密移取450 μL待測(cè)液至核磁管中，精密移取50 μL重水于核磁管中，將二者混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.1.331P-NMR采樣參數(shù)31P-NMR采集條件：反轉(zhuǎn)門控去耦脈沖序列zgig，采樣點(diǎn)數(shù)TD：65536，掃描次數(shù)NS=64，延遲時(shí)間D1=12 s，采集時(shí)間AQ=1.9268 s，譜寬SW=70 ppm，O1P=5 ppm，O2P=4.7 ppm，P1=12 μs，增益RG=203，測(cè)定溫度298 K。采用線寬因子為0.3 Hz的窗函數(shù)對(duì)原始的自由感應(yīng)衰減信號(hào)(FID)進(jìn)行傅里葉變換得到頻域譜，然后用apk進(jìn)行自動(dòng)相位校正, abs進(jìn)行自動(dòng)基線平滑。

1.2.1.4 磷酸鹽含量的測(cè)定 采用式(1)計(jì)算待測(cè)樣品磷酸鹽的含量：

式中，mx為待測(cè)物含量；mstd為內(nèi)標(biāo)含量；Mx為待測(cè)物分子量；Mstd為內(nèi)標(biāo)分子量；Ax為待測(cè)物定量峰信號(hào)面積；Astd為內(nèi)標(biāo)物定量峰信號(hào)面積；nx為待測(cè)樣品定量峰包含的磷原子數(shù)；nstd為內(nèi)標(biāo)物包含的磷原子數(shù)。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 以火腿腸為基質(zhì)，按照1.2.1的處理方法，同一樣品1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算平均值，分析方法的日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每天測(cè)定6次并取平均值，分析方法的日間精密度。

1.2.2.2 回收率實(shí)驗(yàn) 平行稱取火腿腸樣品，用1.2.1的方法進(jìn)行前處理。加入高中低三水平(0.50、2.0、5.0 g/kg)的磷酸鹽，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.3 離子色譜法對(duì)比

1.2.3.1 前處理 參照GB 5009.256-2016的方法[8]。稱取2.5 g火腿腸樣品，用50 mmol/L氫氧化鈉溶液洗入100 mL 比色管中混勻定容至刻度，80 ℃超聲提取30 min，每隔 5 min 振搖一次, 保持固定相完全分散。冷卻至室溫后, 溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾; 取濾液于4 ℃下，8000 r/min 離心10 min，取上清液備用。取濾液15 mL，通過(guò)0.45 μm水性濾膜針頭過(guò)濾器、Ag柱和Na 柱，棄去前7 mL，收集后面洗脫液待測(cè)。

1.2.3.2 色譜分析條件 使用DionexIonPac AS19型離子色譜柱(4 mm×250 mm) ，檢測(cè)條件為：柱溫30 ℃；流速1. 0 mL /min；進(jìn)樣量25 μL；氫氧化鉀溶液梯度淋洗，0～10 min，25～60 mmol/L，10～28 min，保持60 mmol/L，28～30 min，60～25 mmol/L，30～35 min，保持25 mmol/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用TopSpin、MestReNova、Office及Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇 比較了不同pH的緩沖鹽及超純水對(duì)肉制品中磷酸鹽的提取效果。以1.0 mg/mL的焦磷酸鈉為例，比較了其在pH=4.5醋酸緩沖鹽、pH=7.0的超純水、pH=9.0的硼酸緩沖鹽下的化學(xué)位移(δ，ppm)，分別為δ=-9.40 ppm、δ=-7.4 ppm、δ=-6.50 ppm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pH越大，其化學(xué)位移越大。在實(shí)際樣品中，相同磷酸鹽的化學(xué)位移會(huì)因?yàn)閜H不同而導(dǎo)致化學(xué)位移變化，從而造成峰歸屬分類錯(cuò)誤，因此不適合使用水去提取磷酸鹽，而需采用緩沖鹽提取。由于磷酸鹽在酸性條件下容易發(fā)生水解，因此本實(shí)驗(yàn)最后選擇pH=9.0的硼酸緩沖鹽保持樣品提取溶液pH穩(wěn)定，進(jìn)行磷酸鹽提取。本實(shí)驗(yàn)還以焦磷酸鈉和焦磷酸鉀為例，比較了鈉鹽和鉀鹽的化學(xué)位移，在相同pH下，其化學(xué)位移相同。

2.1.2 凈化方式 比較了C18固相萃取、Ag/H固相萃取小柱、CHCl3有機(jī)試劑沉淀、直接離心過(guò)膜上機(jī)共4種方法對(duì)磷酸鹽測(cè)定含量的影響，結(jié)果表明4種方法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明31P-NMR在測(cè)定磷酸鹽時(shí)，抗干擾能力強(qiáng)，無(wú)需復(fù)雜前處理即可進(jìn)行測(cè)定。

2.2 NMR實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇

2.2.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇 用于qNMR理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足以下條件：內(nèi)標(biāo)的定量峰與待測(cè)樣品的定量峰分離良好，易溶于測(cè)試溶劑，不與待測(cè)樣品相互作用。常見(jiàn)的定量?jī)?nèi)標(biāo)物有磷酸氫二鉀、六甲基磷酰三胺、亞甲基二磷酸、磷酸三苯酯、三苯基膦等。不同磷酸鹽的化學(xué)位移δ分布在5.0～-25.0 ppm，故宜選取內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)位移δ大于10 ppm。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選取六甲基磷酰三胺(HMPA)為內(nèi)標(biāo)，其化學(xué)位移為29.91 ppm(使用H3PO3校準(zhǔn))，與各目標(biāo)化合物分離度好。4種磷酸鹽和內(nèi)標(biāo)的圖譜如圖1所示。

圖1 磷酸鹽的31P-NMR圖譜Fig.1 31P-NMR spectra of phosphates

2.2.2 延遲時(shí)間D1使用標(biāo)準(zhǔn)序列t1irpg測(cè)定各化合物的弛豫時(shí)間T1，各化合物的T1如表1所示。一般認(rèn)為當(dāng)延遲時(shí)間D1≥5T1時(shí)，目標(biāo)化合物的響應(yīng)達(dá)到最大，此時(shí)定量準(zhǔn)確。按照一般性要求，本實(shí)驗(yàn)D1的值需要設(shè)定為55 s。但過(guò)大的D1會(huì)導(dǎo)致單次掃描時(shí)間增加，分析時(shí)間顯著加長(zhǎng)。為了縮短單次掃描耗時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)研究了在相同掃描次數(shù)下，D1分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、14、16、18、20、25、30、50、60 s時(shí)各化合物的的響應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)D1在0.1～12 s時(shí)，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，但在12 s后信號(hào)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，因此本實(shí)驗(yàn)將D1設(shè)為12 s。

表1 各化合物的弛豫時(shí)間(T1)Table 1 Relaxation time (T1) of each compound

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法準(zhǔn)確度分析 核磁定量分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，本實(shí)驗(yàn)使用3種不同方法驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。配制4種磷酸鹽(以陰離子根計(jì))的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線為40、100、300、500、800、1000、1500、2000 μg/mL，內(nèi)標(biāo)加入濃度為800 μg/mL。方法①：以4種磷酸鹽定量峰信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)y，以濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸繪制曲線。方法②：以4種磷酸鹽與內(nèi)標(biāo)物定量峰的信號(hào)強(qiáng)度比為縱坐標(biāo)y，以4種磷酸鹽與內(nèi)標(biāo)物濃度比為橫坐標(biāo)x軸，進(jìn)行線性回歸繪制曲線。方法③：使用內(nèi)標(biāo)絕對(duì)測(cè)定法(即本文的1.2.1.4公式)，利用HMPA的峰面積和質(zhì)量計(jì)算出其它4種磷酸鹽的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用①和②時(shí)，y與x均成線性，且決定系數(shù)R2>0.999，線性方程及決定系數(shù)見(jiàn)表2。由表2看出31P-qNMR信號(hào)響應(yīng)穩(wěn)定，濃度與定量峰面積成正比。使用方法③內(nèi)標(biāo)定量，HMPA峰面積計(jì)算PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的含量分別為實(shí)際含量的112.0%、102.5%、103.2%、101.8%，表明該方法使用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法計(jì)算結(jié)果均準(zhǔn)確。使用內(nèi)標(biāo)絕對(duì)測(cè)定法不需要4種磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)品，且一次采集就可定量4種不同磷酸鹽，因此文章選擇第3種方法進(jìn)行精密度、回收率等方法學(xué)實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)圖譜及化學(xué)位移見(jiàn)圖1標(biāo)注，實(shí)際樣品圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)際樣品的31P-NMR圖譜Fig.2 31P-NMR spectra of samples

表2 各化合物的線性方程及決定系數(shù)Table 2 Linear equations and coefficients of determination of compounds

2.3.2 精密度分析 參照吉鑫等[23]定量測(cè)定食品中水蘇糖的精密度分析方法并加以改動(dòng)。按照本文1.2.2.1的方法進(jìn)行測(cè)試，采用HMPA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定肉制品中磷酸鹽的日內(nèi)精密度為0.68%～3.55%，日間精密度為1.12%～4.51%，且日內(nèi)與日間兩者磷酸鹽測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，方法精密度高。

2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn) 采用本文1.2.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定。往基質(zhì)中添加高中低三水平的磷酸鹽，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示，采用HMPA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定肉制品中磷酸鹽的回收率為97.0%～112.0%，RSD為0.87%～3.15%。

表3 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 standard addition recoveries and relative standard deviations of the methods

2.3.4 檢出限 肖坤等[24]在使用1H-NMR測(cè)定食用油中的脂肪酸時(shí)指出qNMR方法的定量限很難達(dá)到英國(guó)藥典要求的S/N≥150，并認(rèn)為依據(jù)中國(guó)藥典四部通則(2015版)規(guī)定，以信噪比為 3 或 2 時(shí)的相應(yīng)濃度確定檢出限。本研究使用31P-NMR也難以達(dá)到S/N≥150的要求，因此本研究未明確評(píng)價(jià)定量限，以信噪比 S /N≥2確定檢出限。依照1.2.1.3的方法測(cè)試，掃描時(shí)間為14 min 53 s，PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的檢出限分別為0.15、0.15、0.15、0.30 g/kg。

2.3.5 方法比對(duì) 使用1.2.1的核磁共振方法和1.2.3離子色譜法分別對(duì)10份市售火腿腸進(jìn)行含量測(cè)試，結(jié)果如表4所示，兩種檢測(cè)方法的含量無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步驗(yàn)證31P-NMR方法準(zhǔn)確、可靠。結(jié)果也表明在肉制品中磷酸鹽含量普遍較高，這與文獻(xiàn)的報(bào)告結(jié)果一致[4]。

表4 不同檢測(cè)方法的含量對(duì)比Table 4 Content comparison of different detection methods

3 結(jié)論

本研究以HMPA為內(nèi)標(biāo)，利用31P-NMR方法，加標(biāo)回收率為97.0%～112.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.87%～3.15%。日內(nèi)精密度為0.68%～ 3.55%，日間精密度為1.12%～4.51%。該方法與離子色譜法[8]相比不需消耗有機(jī)試劑，不需復(fù)雜的提取及凈化等前處理過(guò)程，在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品情況下，可快速定性定量測(cè)定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽，單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間為14 min 53 s，與離子色譜法[8]單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間60 min相比，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)效率顯著提高，是一種新穎的檢測(cè)方法，對(duì)肉制品中磷酸鹽的定量測(cè)定具有很好的準(zhǔn)確性和廣泛的適用性。然而31P-qNMR也存在一定的缺陷，比如靈敏度不高，對(duì)微量成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量仍存在難度，需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)適合31P檢測(cè)的高靈敏度的探頭；并且核磁共振設(shè)備的普及率遠(yuǎn)不及其它色譜儀器，限制了這項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。但是，隨著核磁技術(shù)的不斷進(jìn)步、靈敏度不斷的提高，定量核磁共振技術(shù)必然會(huì)迎來(lái)廣闊的應(yīng)用前景。