基于高通量測序技術(shù)分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多樣性的研究

馬 靜，張琳琳，柴沙駝，王 迅，崔占鴻，孫 璐, ，劉書杰,

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，青海西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016)

青藏高原及其毗鄰地區(qū)的牦牛是當(dāng)?shù)啬撩裆a(chǎn)生活及畜牧經(jīng)濟(jì)主要的畜種之一，能很好地適應(yīng)高海拔缺氧的環(huán)境并為人類提供乳、肉和運(yùn)輸?shù)然举Y源[1]。牦牛乳被稱為天然濃縮乳，所含的營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸、礦物質(zhì)(磷除外)大多均高于其他牛乳[2-4]。牦牛與奶(肉)牛的F1后代為犏牛[5]，具有雜種優(yōu)勢，適應(yīng)性更強(qiáng)，且母犏牛比母牦牛的乳產(chǎn)量高。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)雖然牦牛乳和犏牛乳都具有豐富的脂肪酸，犏牛乳具有高端牛奶的資源優(yōu)勢，乳質(zhì)優(yōu)良，氣味芬芳，營養(yǎng)豐富[6-8]。牛乳作為人類飲食生活的重要組成成分，幾乎適合所有年齡段的人食用，乳中豐富的微生物區(qū)系與人類健康密切相關(guān)，一些微生物可能會(huì)降低炎性腸病，腹瀉，便秘，食物過敏甚至結(jié)腸癌的發(fā)病率[9]。牛乳除了含有多種對機(jī)體健康有益的微生物之外，還存在一些對人類健康有威脅的致病菌如：李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌等[10]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，牛乳微生物組成的神秘面紗被逐漸揭開。早期研究中，采用傳統(tǒng)的美蘭實(shí)驗(yàn)法對牦牛乳微生物的含量有了初步的了解[11]。此外，肜豪峰等[12]采用稀釋平板涂布法分離計(jì)數(shù)對牦牛乳及其制品中微生物區(qū)系進(jìn)行了分析。微生物在極端環(huán)境下經(jīng)過長期的自然選擇，具備相對特殊的結(jié)構(gòu)、機(jī)能以及遺傳特性[13-14]。其群落結(jié)構(gòu)組成不僅受環(huán)境差異影響還和來源動(dòng)物有關(guān)，宿主動(dòng)物的來源不同直接影響著乳微生物群落結(jié)構(gòu)組成[15]。已知犏牛乳品質(zhì)的雜種優(yōu)勢，但其微生物組成及種類還不清楚。因此，開展牦牛乳和犏牛乳中的微生物組的研究非常必要。

近年來越來越多的證據(jù)表明，高通量測序技術(shù)可以克服基于微生物培養(yǎng)的檢測方法的局限性，因此被用來快速鑒定微生物和發(fā)現(xiàn)新微生物[16-17]，廣泛的用于各個(gè)領(lǐng)域。如16S rDNA來檢測食品中的微生物群落結(jié)構(gòu)及鑒定綿羊糞便微生物群的多樣性和功能[18-19]。綜上所述，牦牛乳和犏牛乳作為青藏高原特色乳其營養(yǎng)價(jià)值較高，但目前對兩種原乳微生物結(jié)構(gòu)組成差異及優(yōu)勢菌群了解較少，因此本試驗(yàn)通過提取牦牛乳和犏牛乳中微生物的DNA進(jìn)行高通量測序，更加全面的展現(xiàn)了牦牛和犏牛乳微生物組成差異及多樣性，以期為牦牛乳及犏牛乳制品的開發(fā)利用及優(yōu)勢菌群的發(fā)掘等提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛乳樣品采集信息 采樣時(shí)間：2019年7月至8月。采樣地點(diǎn)：在青海省貴南縣塔秀鄉(xiāng)達(dá)隆村夏曲駿周太畜牧業(yè)專業(yè)合作社。選取自然放牧狀態(tài)下全天候隨群放牧的未進(jìn)行任何補(bǔ)飼的體況一致的泌乳中期4～5胎次的健康牦牛(yak)和犏牛(dzo)各5頭，每頭各采3份，共采生鮮牦牛乳15份，生鮮犏牛乳15份，兩種生鮮乳各五組，一組因污染剔除，牦牛乳和犏牛乳各剩四組(yak5.2,yak5.6,yak5.7,yak5.10;dzo16.2,dzo16.6,dzo16.7,dzo16.10)，每組乳樣取50 mL，分為兩部分：取45 mL至離心管(康寧/Corning公司)中，干冰速凍后于-20 °C冰箱儲(chǔ)存，用于乳常規(guī)營養(yǎng)成分分析。取5 mL于無菌無酶凍存管(康寧/Corning公司)中，液氮速凍后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-80 °C冰箱儲(chǔ)存，用于測定微生物多樣性及組成。

FOSS多功能乳制品分析儀(MilkoScan FT1) 上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；DCC體細(xì)胞檢測儀 利拉伐天津有限公司；超低溫冰箱(-80 ℃) 美國Thermo公司；Fresco21型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；Tprofessiona PCR儀 德國Biometral公司；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)、PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽(20 cm×25 cm)美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛乳和犏牛乳常規(guī)營養(yǎng)成分分析 采用FOSS FT-1乳品分析儀測定牦牛乳和犏牛乳常規(guī)營養(yǎng)成分。

1.2.2 基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增、測序 采用SDS法提取基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用無菌水將其稀釋至1 ng/μL作為PCR模板，使用帶 Barcode 的特異性引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806R(5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，New England Biolabs

公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer及高效高保真酶對特定區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min后，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

所得PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒(MinElute Gel Extraction Kit)回收產(chǎn)物。然后使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣、純化，文庫的構(gòu)建和上機(jī)測序流程均由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 測序數(shù)據(jù)處理 根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(Version1.2.http://ccb.jhu.edu/software/FLAS H/)對每個(gè)樣本的Reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)；拼接得到的原始Tags數(shù)據(jù)，經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。參照Qiime(Version1.9.1.http://qiime.org/scripts/split_libr aries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行Tags截取及長度過濾之后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.3.2 菌群多樣性分析 通過Uparse軟件(Uparse version7.0.1001.http://www.drive5.com/uparse/)對所有樣本進(jìn)行聚類，用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，獲得在各個(gè)分類水平分類學(xué)信息。通過Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線及Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

基于Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Unifrac，并通過R軟件進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。然后對菌群組成進(jìn)行多級物種差異判別分析(LEfSe)，默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4，且利用R軟件分析組間差異顯著的物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳和犏牛乳常規(guī)營養(yǎng)成分對比

牦牛乳和犏牛乳的9個(gè)常規(guī)營養(yǎng)成分檢測，并利用SAS 9.4在0.05水平下對其進(jìn)行顯著性單因素方差分析，結(jié)果如表1所示。牦牛乳中各項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果均高于犏牛乳，且二者蛋白、非脂固形物、總?cè)楣绦挝锛懊芏鹊牟町愶@著(P<0.05)。

表1 牦牛和犏牛乳常規(guī)營養(yǎng)成分Table 1 Nutritional component contents of yak and cattle-yak milk

2.2 微生物多樣性分析

2.2.1 樣品測序結(jié)果及多樣性指數(shù) 經(jīng)PCR-free文庫構(gòu)建、測序、Reads拼接后平均每樣品測得93918條序列，經(jīng)質(zhì)控過濾平均得到75922條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達(dá)63698，質(zhì)控有效率達(dá)68.28%?；?7%一致性對OTUs進(jìn)行注釋，共得到5516個(gè)OTUs。如圖1所示，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明測序結(jié)果合理，且間接反映了物種的豐富度，即樣本的當(dāng)前測序深度足夠反映該群落樣本所包含的微生物多樣性。如圖2所示，Rank Abundance曲線直觀地反映樣品中物種的豐富度和均勻度，水平方向的曲線跨度體現(xiàn)了物種豐富度，曲線在橫軸上的范圍較大，表明物種豐度較高；垂直方向的曲線漸進(jìn)平緩，表明物種分布均勻。

圖1 Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖Fig.1 Rarefaction curve for Alpha diversity index

圖2 Rank Abundance曲線Fig.2 Rank Abundance curve

如表2所示，采用Shannon和Simpson指數(shù)對牦牛乳和犏牛乳中微生物的多樣性進(jìn)行評價(jià)，采用Observed species和Chao1對二者微生物菌群的豐度進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明犏牛乳中所含物種數(shù)較牦牛乳高，二者微生物菌群豐度差異顯著，但菌群多樣性相似。

表2 基于T檢驗(yàn)的Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Alpha diversity index analysis based on T test

2.2.2 微生物群落組成分析

2.2.2.1 物種韋恩圖分析 由圖3可知，共測得5516個(gè)OTUs，共有OTUs 2506個(gè)，牦牛乳組(yak)和犏牛乳組(dzo)分別特有1054和1956個(gè)OTUs，犏牛乳特有的OUTs相對牦牛乳較高，表明犏牛乳中的微生物群落較牦牛乳豐富。

圖3 韋恩圖Fig.3 Venn graph

2.2.2.2 微生物門分類水平的比較 牦牛乳和犏牛乳在門水平上前10種微生物相對豐度比較結(jié)果如圖4顯示，牦牛乳和犏牛乳中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度分別為29.80%、45.36%；厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度分別為35.99%、25.79%；放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度分別為8.41%、7.39%。從菌群門水平排名前十的熱圖(圖5)可知，犏牛乳中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)及變形菌門等較為常見，而牦牛乳則以厚壁菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)及柔膜菌門(Tenericutes)為主。

圖4 門水平下微生物的相對豐度Fig.4 Relative abundance of microorganisms at phylum level

圖5 微生物門水平熱圖Fig.5 The heat map of microorganisms at phylum level

2.2.2.3 微生物屬分類水平的比較 牦牛乳和犏牛乳微生物前10屬水平比較如圖6所示，結(jié)果表明牦牛乳中的優(yōu)勢菌屬為未分類的藍(lán)藻細(xì)菌屬(unidentified-Cyanobacteria)；犏牛乳中優(yōu)勢菌屬為慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，其次是耶爾森菌屬(Yersinia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及貪銅菌屬(Cupriavidus)。兩種牛乳中都含有這幾種微生物，但所占比例差異較大。耶爾森菌屬和貪銅菌屬在犏牛乳中所占比例明顯高于牦牛乳，而乳桿菌屬的含量在犏牛乳中較牦牛乳相比更低。

圖6 屬水平下微生物的相對豐度Fig.6 Relative abundance of microorganisms at genus level

2.2.2.4 微生物種分類水平的比較 牦牛乳和犏牛乳微生物前10種水平比較表明，埃爾坎尼中慢生根瘤菌種(Bradyrhizobium elkanii)和Kosakonia oryzae為牦牛乳和犏牛乳中的優(yōu)勢菌種，其中埃爾坎尼中慢生根瘤菌種在犏牛乳中的相對豐度較高，達(dá)11.53%，比牦牛乳中所占比例高；菌種Kosakonia oryzae在犏牛乳(5.53%)的占比同樣比牦牛乳(3.36%)高(圖7)。

圖7 種水平下微生物的相對豐度Fig.7 Relative abundance of microorganisms at species level

2.2.2.5 物種主坐標(biāo)分析 基于unweightedUnifrac距離進(jìn)行物種主坐標(biāo)分析(圖8)，結(jié)果顯示，第一主成分對樣品差異的解釋率為25.57%，第二主成分對樣品差異的解釋率為18.39%。牦牛乳和犏牛乳分別聚集在一起，兩組樣本距離較近，由此可知，牦牛乳和犏牛乳微生物群落差異輕微。

圖8 基于unweightedUniFrac距離的PCoA主坐標(biāo)分析Fi g.8 PCoA analysis based on unweightedUniFrac distance

2.2.3 組間差異分析 對牦牛、犏牛乳的LEfSe分析，LDA線性判別分析結(jié)果見圖9A，LDA score>4的物種共有八種，其中莫拉菌科(Moraxellaceae)、假單 胞 菌 目(Pseudomonadales)、莫 拉 氏 菌 屬(Moraxella)及肉桿菌科(Carnobacteriaceae)對牦牛乳的菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響；δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、unidentified_Gammaproteobacteria、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)及α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)則與犏牛乳微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)。

圖9 LEfSe組間差異分析Fig.9 LEfSe analysis of differences between groups

2.3 乳常規(guī)和微生物相關(guān)性分析

圖10為優(yōu)勢物種Spearman相關(guān)系數(shù)分析熱圖，揭示了環(huán)境因子與物種之間的關(guān)系。縱向?yàn)榄h(huán)境因子信息(脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂固形物和總?cè)楣绦挝?，橫向?yàn)槲锓N信息(微生物)，中間熱圖對應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù)r，介于-1和1之間，r<0為負(fù)相關(guān)，r>0為正相關(guān)。由圖可知，牦牛乳和犏牛乳中的共性優(yōu)勢菌門中的變形菌門與乳脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂固形物及總?cè)楣绦挝锞守?fù)相關(guān)；放線菌門與乳糖呈負(fù)相關(guān)，與其他的指標(biāo)呈正相關(guān)；牦牛乳中主要的厚壁菌門與乳脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂固形物及總?cè)楣绦挝锞收嚓P(guān)；異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus) 與牦牛乳和犏牛乳中具有顯著差異的蛋白質(zhì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；犏牛乳中常見的芽單胞菌門與脂肪、乳糖及總?cè)楣绦挝锍收嚓P(guān)，與蛋白質(zhì)、非脂固形物呈負(fù)相關(guān)。

圖10 Spearman相關(guān)性分析熱圖Fig.10 Spearman correlation analysis heat map

3 討論

牦牛乳作為藏區(qū)牧民營養(yǎng)攝取的主要來源之一，對多種疾病有較好的預(yù)防作用，有助于降低代謝綜合征發(fā)病率[20]。本試驗(yàn)通過對牦牛乳和犏牛乳常規(guī)營養(yǎng)成分的測定，得出牦牛乳和犏牛乳的蛋白質(zhì)、非脂固形物、總?cè)楣绦挝锛懊芏炔町愶@著(P<0.05)。引起乳營養(yǎng)成分含量差異的原因有很多，如牛群遺傳特性、泌乳生理差異及日糧營養(yǎng)結(jié)構(gòu)等[21]。而該試驗(yàn)在同一飼養(yǎng)環(huán)境中，且年齡、泌乳期、胎次、健康狀況基本相同的前提下進(jìn)行的，則出現(xiàn)這種差異的主要原因可能取決于品種及個(gè)體遺傳因素。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們已經(jīng)了解到家畜的原乳有自己獨(dú)特的內(nèi)原微生物群落，對人類和家畜后代的健康都有影響[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示犏牛乳的細(xì)菌豐富度較牦牛乳高，而兩種乳的細(xì)菌多樣性相似。犏牛作為牦牛和黃牛的雜交品種，其雜種優(yōu)勢明顯，由韋恩圖分析結(jié)果可知牦牛乳和犏牛乳二者所共有的微生物物種很多，但犏牛乳中特有的微生物與物種高于牦牛乳，推測犏牛雜種優(yōu)勢及遺傳特性可能是其乳中細(xì)菌豐富度較高的原因[23-24]。在微生物門分類水平上，與張敏[25]的研究結(jié)果相似。此外，本研究結(jié)果牦牛乳中擬桿菌門的含量也較多。擬桿菌門的擬桿菌通過抑制脂肪細(xì)胞中脂蛋白脂酶活性，從而對脂質(zhì)代謝產(chǎn)生積極影響，且該菌與家畜腸道免疫有關(guān)[26]。當(dāng)機(jī)體脂質(zhì)代謝異常時(shí)則會(huì)引起許多常見的疾病，對機(jī)體健康造成威脅。因此，牦牛乳可能對家畜脂質(zhì)代謝及提高食用者及有犢牛的腸道免疫有積極影響，更有利于脂肪在小腸的消化吸收為機(jī)體提供所需要的能量，但這需要進(jìn)一步試驗(yàn)來證明。本試驗(yàn)在屬水平上主要的優(yōu)勢屬為慢生根瘤菌屬、耶爾森菌屬及未分類的藍(lán)藻細(xì)菌屬，與發(fā)酵乳制品優(yōu)勢菌屬相比完全不同，鮮乳通過不同的加工方式加工后其細(xì)菌的多樣性及種屬結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變。耶爾森菌屬中的部分菌種會(huì)通過破壞細(xì)胞死亡途徑，擾亂炎癥過程并利用免疫細(xì)胞促進(jìn)疾病，對人類具有致病性[27]。而結(jié)果中含有該細(xì)菌，可能是因?yàn)榕Ｈ樵跀D奶過程中被外界環(huán)境所污染，有研究表明，耶爾森菌屬多存在于糞便中，由此推斷，有害菌群的產(chǎn)生可能是因?yàn)殛笈ｏ曫B(yǎng)管理不當(dāng)，采樣時(shí)牛乳可能被糞便污染所致[28]。乳桿菌屬是一類能夠利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的桿狀細(xì)菌，長期以來被用于制造乳制品，該菌屬有25個(gè)菌種部分具有產(chǎn)生抗氧化劑并且具有益生菌潛力，通過抗炎反應(yīng)參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[29]。犏牛乳中乳桿菌屬的比例更高，可能是更理想的原料奶。

通過 Spearman相關(guān)性分析比較乳常規(guī)和微生物的關(guān)系，牦牛乳和犏牛乳中的變形菌門與乳脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂固形物及總?cè)楣绦挝锍守?fù)相關(guān)，而厚壁菌門與乳常規(guī)營養(yǎng)成分呈正相關(guān)。有研究報(bào)道，厚壁菌門與小鼠肥胖密切相關(guān)，促進(jìn)腸道對單糖的吸收，誘導(dǎo)脂肪形成[30-31]。細(xì)菌門水平分類比較結(jié)果表明，牦牛乳中的厚壁菌門含量較犏牛乳高，而乳常規(guī)營養(yǎng)成分分析結(jié)果同樣也表明牦牛乳中脂肪和乳糖含量比犏牛乳高。牦牛乳中脂肪和乳糖含量較高的原因可能與此有關(guān)。

4 結(jié)論

營養(yǎng)成分分析：牦牛乳和犏牛乳蛋白質(zhì)、總?cè)楣绦挝?、非脂固形物及密度差異顯著(P<0.05)，其他乳常規(guī)營養(yǎng)成分差異不顯著。微生物多樣性分析：牦牛乳和犏牛乳微生物豐度差異明顯，且犏牛乳的微生物豐度及多樣性較高。通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩種乳營養(yǎng)成分含量的差異與其微生物組成之間具有相關(guān)性。這為進(jìn)一步研究青藏高原牦牛乳和犏牛乳的營養(yǎng)調(diào)控提供了理論依據(jù)。