重組人汗腺抗菌素蛋白的異源可溶表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化及分離純化研究

馬文君，郭校燕，滕 琳，王培培，衛(wèi)宏遠(yuǎn)，鄭春陽(yáng)

(1.天津大學(xué)，天津 300350；2.天津強(qiáng)微特生物科技有限公司，天津 300384；3.舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司，北京 101100；4.守正創(chuàng)新生物科技（天津）有限公司，天津 300384)

一些食品添加劑如亞硝酸鹽和二氧化硫等化學(xué)防腐劑的過(guò)量使用可能會(huì)對(duì)人體健康和食品營(yíng)養(yǎng)水平造成不良影響[1]。由于過(guò)度使用化學(xué)防腐劑，細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，因此迫切需要尋找新的天然防腐劑來(lái)保存食品[2]?？咕氖菑V泛存在于動(dòng)植物、昆蟲和細(xì)菌中的一類天然細(xì)胞多肽[3]。使用抗菌肽作為生物防腐劑對(duì)食品進(jìn)行保鮮，可以同時(shí)提高食品的貨架期和對(duì)人體的安全性[4-5]。它可以保護(hù)宿主免受病原微生物的侵害。抗菌肽的發(fā)現(xiàn)有望成為化學(xué)防腐劑的替代品，其中乳鏈菌肽(Nisin)是目前食品保鮮中應(yīng)用最廣泛的抗菌肽[6]。

人汗腺抗菌素DCD-1L是一種來(lái)源于人體皮膚的抗菌肽，穩(wěn)定性好，在汗液中至少能抵抗蛋白水解長(zhǎng)達(dá)40 h。DCD-1L是德國(guó)科學(xué)家Shcittek等[7]2001年從人體汗液中分離得到的小分子陰離子抗菌肽，具有廣泛應(yīng)用前景。比如，DCD-1L有很好的抗菌活性，它能夠抑制多種病原微生物，對(duì)抗包括金黃色葡萄球菌、糞大腸桿菌、大腸埃希菌、惡臭假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等在內(nèi)的細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性[8-9]。目前，獲得DCD-1L的方式包括：從人汗液中直接分離、化學(xué)合成和基因重組表達(dá)等[10]。DCD-1L在人體汗腺中濃度為1～10 μg/mL，從人汗液分離DCD-1L是一個(gè)非常煩瑣的過(guò)程，而且分離的量有限[11]，而化學(xué)合成DCD-1L成本太高。通過(guò)基因重組表達(dá)技術(shù)分離純化抗菌肽是目前廣泛采用的方法，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以有效改善真核表達(dá)系統(tǒng)如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠成本高、周期長(zhǎng)，產(chǎn)業(yè)化困難的現(xiàn)狀[12-13]。DCD全長(zhǎng)110個(gè)氨基酸殘基，成熟的DCD-1L是位置在63～110的48個(gè)氨基酸，分子量4.8 kDa[14]。許多學(xué)者分別利用畢赤酵母表達(dá)和大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行DCD-1L的誘導(dǎo)表達(dá)，其中畢赤酵母表達(dá)量過(guò)低無(wú)法進(jìn)行后續(xù)研究[15-16]。賴玉平[16]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以融合蛋白形式進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)DCD-1L，但是表達(dá)后還需要蛋白酶酶切釋放DCD-1L。目前的報(bào)道主要集中在重組質(zhì)粒的構(gòu)建[17-19]，關(guān)于后期純化的報(bào)道相對(duì)較少：如Cipáková在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)一種含有C-末端高絲氨酸內(nèi)酯的DCD-1L-1Hsl，再利用溴化氰CNBr水解法裂解融合蛋白蛋氨酸的C末端，但其裂解效率較低，并不適合大規(guī)模生產(chǎn)[20]。在另一項(xiàng)研究中，利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)重組融合蛋白DCD-1L，再通過(guò)幾丁質(zhì)親和層析純化[21]。IMPACT系統(tǒng)完全避免了蛋白酶的使用，可以有效降低成本。但是，intein需要在較低的溫度和還原條件下才發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解，從而釋放出與之相連的目的蛋白，然而還原劑的存在會(huì)破壞/影響蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[22]。Ushanandin等[9]利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組DCD-1L，后續(xù)還要利用Ulp1蛋白酶切除SUMO標(biāo)簽，而Ulp1蛋白酶對(duì)酶解溫度和pH有較高的要求[23]，對(duì)DCD-1L的后續(xù)純化提出更高的要求。

本文在先前研究的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)基因工程技術(shù)，將優(yōu)化的DCD-1L基因片段克隆到pET28a + 載體上，以His組氨酸為標(biāo)簽，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株，將確定可誘導(dǎo)表達(dá)DCD-1L的菌株，經(jīng)過(guò)大規(guī)模發(fā)酵、分離和純化，獲得高純度的DCD-1L，并初步對(duì)其抗菌活性進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、Escherichia coliBL21 (DE3)、Escherichia coliER2566、質(zhì)粒pET28a+ 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶 New England Biolabs公司；膠回收試劑盒 Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；SDSPAGE電泳凝膠試劑盒、高保真PCR聚合酶 天津強(qiáng)微特生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用純化填料 均來(lái)自美國(guó)GE healthcare；其他試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

超濾管超濾離心管 美國(guó)Millipore公司；AKTApurifier TM100純化系統(tǒng) 美國(guó)GE healthcare；SCIE10TI-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；垂直電泳儀 美國(guó) Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；液體發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；單四極桿質(zhì)譜儀(LC-MSD) 美國(guó)安捷倫公司；UV3100紫外可見光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人源DCD-1L的基因克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI上人源DCD -1L基因編碼的堿基序列信息(Gene ID：117159)，確定目的基因序列如下：5，-CATATGAGTAGTCTGCTGGAAAAAGGCCTGG ATGGCGCAAAAAAGGCAGTTGGCGGCCTGGG CAAACTGGGTAAAGATGCCGTTGAAGATCTG GAAAGTGTGGGTAAAGGCGCCGTGCATGATG TGAAAGATGTGCTGGATAGCGTTCTGTAACAT ATG-3，其氨基酸組成序列為：SSLLEKGLDGA KKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHD VKDVLDSVL，確定本實(shí)驗(yàn)的目的克隆序列。

經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成目的基因片段由通用生物公司合成，通過(guò)無(wú)縫連接技術(shù)將目的片段插入到pET28a+上，得到質(zhì)粒pET28a-DCD-1L。將構(gòu)建好的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeI酶切驗(yàn)證，配制50 μL反應(yīng)體系(5 μL的NEBuffer，1 μL NdeI酶)，在37 ℃條件下反應(yīng)1 h，將所得酶切產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。將經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)和E. coliER2566感受態(tài)細(xì)胞，用Kan抗性平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，將篩選得到的正確克隆菌株，加入甘油，進(jìn)行-80℃保藏，用于后續(xù)研究。

1.2.2 DCD-1L的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 將-80 ℃保藏的重組表達(dá)菌株BL21 (DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L復(fù)蘇后，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，100 r/min振蕩過(guò)夜活化。將活化的BL21(DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L繼 續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)接種于100 mL含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中。當(dāng)菌液A600達(dá)0.5～0.7時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1～1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)條件優(yōu)化后，確定誘導(dǎo)劑IPTG的添加量為0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜，菌體經(jīng)6000 × g，10 min離心收集，利用超聲破碎儀破碎大腸桿菌細(xì)胞(超聲功率180 W，超聲2 s，暫停2 s，總超聲時(shí)間為5 min)，離心得到菌液上清和沉淀，再用50 mmol/L Tris-HCl將沉淀復(fù)溶，進(jìn)行SDS-PAGE分析，配制12%分離膠和5%濃縮膠，恒定功率10 W，當(dāng)條帶遷移距底端1～2 cm處停止電泳[24]。

由于DCD-1L分子量較小，常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色無(wú)法觀察到目的條帶，因此電泳結(jié)束后選用更加靈敏的硝酸銀染色，操作順序如下：采用30%乙醇，10%乙酸固定至少30 min，用20%乙醇漂洗2次，0.8 mmol/L硫代硫酸鈉中浸泡1 min敏感化、雙蒸水漂洗2次、用12 mmol/L硝酸銀溶液浸漬銀染持續(xù)20～120 min，準(zhǔn)備水和顯影溶液，按照銀染-水-顯影液的順序?qū)⒛z從銀染液中取出，放入水中漂洗10 s，再?gòu)乃腥〕龇湃腼@影液中，輕輕晃動(dòng)，繼續(xù)顯色至條帶清晰，取出放入終止液中至少30 min終止反應(yīng)，用雙蒸水漂洗兩遍，每次30 min[25]。

1.2.3 重組表達(dá)菌株ER2566-pET28a-DCD-1L發(fā)酵條件的研究 取保存于-80 ℃冰箱的菌種，按照1%添加量接于含Kan抗性的600 mL LB培養(yǎng)基中作為種子液，37 ℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按照8%的接種量將種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，設(shè)定溫度和轉(zhuǎn)速同種子液培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)pH，當(dāng)A600=7.8時(shí)，加入7 mL 0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3 h后進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響 利用發(fā)酵罐對(duì)重組表達(dá)菌株ER2566-pET28a-DCD-1L進(jìn)行發(fā)酵，由于體系變大，獲得目的蛋白的最佳溫度不一定同搖瓶發(fā)酵條件一致，因此在10 L發(fā)酵罐中，分別控制溫度為27、32、37及42 ℃進(jìn)行發(fā)酵，研究溫度對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響。每隔6 h取樣跑膠進(jìn)行SDS-PAGE，用Image J軟件分析電泳條帶灰度，計(jì)算目的蛋白條帶所占百分比從而確定目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)情況。

1.2.3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響 采用優(yōu)化發(fā)酵溫度，分別控制攪拌轉(zhuǎn)速為250、300、350和400 r/min進(jìn)行攪拌，研究攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響。

1.2.3.3 補(bǔ)料速度對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響 采用優(yōu)化發(fā)酵溫度及攪拌轉(zhuǎn)速，當(dāng)A600=1.0時(shí)開始補(bǔ)充高濃度0.125 g/mL胰蛋白胨、0.125 g/mL酵母粉和0.25 g/mL葡萄糖，兩種溶液分別高溫滅菌后，接種前混合均勻后連接到發(fā)酵罐，開啟蠕動(dòng)泵分別以30、50、70和90 mL/30 min補(bǔ)料速度自動(dòng)加入發(fā)酵罐中，確定補(bǔ)料速度對(duì)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)量的影響。

1.2.4 重組DCD-1L的純化 將發(fā)酵液離心后收集菌體(14000 r/min，25 min，4 ℃)，用50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl，0.1 mmol/L PMSF，按照質(zhì)量比1∶20重懸分散菌體，高壓均質(zhì)破菌均質(zhì)3次壓力分別為(300、850和950 bar)離心后收集上清液(14000 r/min，25 min，4 ℃)，過(guò)0.45 μm濾膜，獲得上清液，用于純化。

1.2.4.1 細(xì)胞破碎上清液超濾 取300 mL上述過(guò)濾后的上清液，利用Millipore Amicon? Ultra-15 10 K離心過(guò)濾器，離心條件為4000 r/min，20 min，4 ℃，取濾出部分。

1.2.4.2 細(xì)胞破碎上清液Q柱洗脫 分別配制緩沖溶液Q-A：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，緩沖溶液Q-B：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl。取150 mL破菌上清10 kDa超濾濾出液，以HiTrapQ HP預(yù)裝柱進(jìn)行層析純化。以流速2.5 mL/min，0～50% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，收集各步驟樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4.3 細(xì)胞破碎上清液分子篩 配制pH6.5，10 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl，將Q柱洗脫目的組分經(jīng)過(guò)HiPrep 26/60 Scphacryl S100柱層析，收集各步驟樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)并分析蛋白純度和計(jì)算回收率。以上各步純化所得蛋白樣品均進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果分別用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，計(jì)算出目的蛋白條帶所占每步總蛋白條帶的百分比，即為目的蛋白的純度?；厥章实挠?jì)算是利用Bradford法計(jì)算出高壓均質(zhì)后的蛋白總濃度，乘以目的蛋白的純度即為初始目的蛋白總濃度CTotal，超濾、Q柱、S100柱純化后的目的蛋白濃度測(cè)定方法相同，并分別以CU、CQ和CS表示，相應(yīng)得到的樣品體積為VU、VQ、VS，則各步驟純化后的回收率為：

1.2.5 重組DCD-1L蛋白質(zhì)譜分析鑒定 將上述洗脫后收集的目的峰進(jìn)行單四極質(zhì)譜儀(液相色譜配套6120B)分析，試驗(yàn)參數(shù)為：0 min 70%的水和30%的乙腈，以流量為0.3 mL/min梯度洗脫10 min后，變?yōu)?0%的水、70%的乙腈，質(zhì)譜掃描范圍是115～500，進(jìn)樣量5 μL使用MSD控制，常規(guī)調(diào)譜文件atunes.tun離子源為API-ES，縫寬0.100 min，循環(huán)時(shí)間1.69 s/cycle。

1.2.6 DCD -1L抗菌活性檢測(cè) 本試驗(yàn)選取陰性對(duì)照(pET28a+空載質(zhì)粒破菌后上清)、陽(yáng)性對(duì)照(1 mg/mL氨芐霉素)、pET28a-DCD-1L破菌的上清液和純化得到的DCD-1L蛋白，分別考察其對(duì)表皮葡萄球菌ATCC12228(革蘭氏陽(yáng)性菌)和大腸桿菌DH 5α(革蘭氏陰性菌)生長(zhǎng)的影響。將表皮葡萄球菌ATCC12228，大腸桿菌DH 5α進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，將兩種指示菌分別涂布營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)固體培養(yǎng)基，分別在平皿上放置牛津杯，用移液槍吸取等量的樣液滴至牛津杯中，將平板置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源DCD-1L基因的克隆與載體構(gòu)建和表達(dá)

如圖1所示，構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)NdeI單酶切后，由1%瓊脂糖凝膠結(jié)果可知，目標(biāo)條帶大小為5000～7500 bp，復(fù)合預(yù)期大小5369 bp，將構(gòu)建好質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至不同感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)后檢測(cè)目標(biāo)蛋白DCD-1L表達(dá)情況。

圖1 質(zhì)粒pET28a-DCD-1L經(jīng)NdeI單酶切鑒定圖Fig.1 Identification of the cloning expression vector by NdeI enzyme digestion

如圖2所示，將構(gòu)建好的pET28a-DCD-1L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，目標(biāo)蛋白DCD-1L并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)表達(dá)，誘導(dǎo)前后在低于14.4 kDa沒(méi)有條帶變化。而轉(zhuǎn)化至ER2566感受態(tài)細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的可溶表達(dá)(見圖中紅色虛框)。感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)和ER2566均來(lái)源于BL21，可用于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體(如pET系列)的高水平蛋白表達(dá)[26]，但二者主要區(qū)別在于ER2566為L(zhǎng)on和ompT蛋白酶缺陷菌株。Lon蛋白酶和膜外蛋白酶ompT的缺失能夠有效抑制異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解，提高外源DNA的轉(zhuǎn)化效率[27]。

圖2 SDS -PAGE檢測(cè)不同大腸桿菌菌株對(duì)DCD-1L的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis expression of recombinant DCD-1L in different competent cell

2.2 重組菌ER2566-pET28a-DCD-1L發(fā)酵條件優(yōu)化

大腸桿菌在不同的發(fā)酵條件下，如溫度、轉(zhuǎn)速和補(bǔ)料速度等培養(yǎng)條件下，目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量也會(huì)有很大的差異。因此，為進(jìn)一步研究重組大腸桿菌ER2566-pET28a-DCD-1L的發(fā)酵特性，以提高DCD-1L的產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期，同時(shí)降低發(fā)酵成本，對(duì)重組菌株ER2566-pET28a-DCD-1L的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

由圖3A可知，隨著發(fā)酵溫度的提高細(xì)胞干重和DCD-1L含量逐漸增加，并在37 ℃達(dá)到最高值，42 ℃時(shí)細(xì)胞干重和DCD-1L含量下降。溫度是發(fā)酵生產(chǎn)的重要參數(shù)直接影響細(xì)胞內(nèi)各種酶活性[28]。發(fā)酵溫度升高酶反應(yīng)速率提高，可有效縮短發(fā)酵周期。超過(guò)最適溫度會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)酶失活，菌體容易衰老，影響目的蛋白DCD-1L最終產(chǎn)量。

圖3 重組菌ER2566-pET28a-DCD-1L發(fā)酵條件的研究Fig.3 Study on fermentation conditions of recombinant strain ER2566-pEt28a-DCD-1L

由圖3B可知，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)胞干重和DCD-1L產(chǎn)量具有明顯影響，隨著轉(zhuǎn)速提高細(xì)胞干重和DCD-1L含量逐漸增加。轉(zhuǎn)速影響培養(yǎng)基中的溶氧量，發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分混勻提高菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率；另一方面過(guò)高的轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生影響[29]。本實(shí)驗(yàn)選用較低的轉(zhuǎn)速(不大于400 r/min)，由結(jié)果可知攪拌速度在400 r/min并沒(méi)有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

由圖3C可知，隨著補(bǔ)料速度提高，細(xì)胞干重和DCD-1L產(chǎn)量先增加后降低，過(guò)高的補(bǔ)料速度并不利于菌體生長(zhǎng)，主要原因是快速增長(zhǎng)的菌體會(huì)消耗大量氧氣，使得發(fā)酵罐體溶氧量迅速下降反而不利于菌體生長(zhǎng)[30]。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同溫度、不同轉(zhuǎn)速、不同補(bǔ)料速度等發(fā)酵條件進(jìn)行了研究與優(yōu)化，確定重組大腸桿菌ER2566-pET28a-DCD-1L發(fā)酵生產(chǎn)DCD-1L的最適條件為：接種量為8%，37 ℃，400 r/min，開啟蠕動(dòng)泵以50 mL/30 min補(bǔ)料速度自動(dòng)加入發(fā)酵罐中，進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵。

2.3 重組DCD-1L的分離純化

2.3.1 細(xì)胞破碎上清液超濾 發(fā)酵液離心后收集菌體，菌體經(jīng)過(guò)超高壓均質(zhì)破碎后離心收集上清液，將上清液移入10 kDa超濾管，在4000×g、4 ℃條件下離心超濾20 min，收集流穿，將離心超濾前后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示：空色虛框內(nèi)為目的蛋白，超濾已去除大量雜質(zhì)蛋白，但還有部分殘留。根據(jù)DCD-1L蛋白氨基酸組成，在expasy網(wǎng)站上預(yù)測(cè)其蛋白等電點(diǎn)為5.07(https://web.expasy.org/protparam/#opennewwindow)，隨后利用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂(Q柱)進(jìn)行柱層析。

圖4 超濾前后重組蛋白DCD-1L對(duì)比情況Fig.4 Comparison of recombinant protein DCD-1L before and after ultrafiltration

2.3.2 超濾后上清液Q柱洗脫 將上述超濾后得到的樣品Q柱上樣，梯度洗脫10 min后，用50%～100% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)繼續(xù)洗脫2 min，結(jié)果如圖5所示，在洗脫體積為200～230 mL(約0.4 mol/L NaCl)洗出2個(gè)峰，230～250 mL(約0.7 mol/L NaCl)洗出1個(gè)峰，后對(duì)洗脫結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE，確定先洗脫出來(lái)的兩個(gè)峰為雜峰，最后洗脫出來(lái)的為目的峰(紅色虛框標(biāo)出的為目的蛋白)，由電泳圖可知還有部分雜質(zhì)蛋白的存在，根據(jù)分子量大小區(qū)別，后續(xù)利用分子篩進(jìn)行層析分離。

圖5 重組蛋白DCD-1L Q柱離子交換層析純化曲線Fig.5 Q anion exchange chromatography purification curves of recombinant DCD-1L

2.3.3 Q柱洗脫后分子篩層析 收集Q柱洗脫下來(lái)的目的峰，上樣S100分子篩，經(jīng)過(guò)10 mmol/L PB溶液，pH6.5，0.1 mol/L NaCl洗脫，如圖6所示獲得一個(gè)非對(duì)稱峰，就該峰不同部位分別收集跑SDSPAGE確定，峰尾部分為單一目的條帶。

經(jīng)高壓均質(zhì)獲得的細(xì)胞上清液，依次經(jīng)過(guò)超濾、Q柱、分子篩，最終獲得一條低于14.4 kDa之間的條帶(如圖6)，而預(yù)期重組蛋白大小為4.8 kDa，在14.4 kDa Marker下方。重組人DCD-1L蛋白純化工藝各步驟回收率如表1所示，純化回收得到的產(chǎn)品純度96%以上，總回收率為18.4%。為確定其準(zhǔn)確分子量大小，后續(xù)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

圖6 重組蛋白DCD-1L 分子篩S100純化曲線Fig.6 S100 purification curves of recombinant DCD-1L

表1 重組人DCD-1L蛋白純化工藝各步驟回收率Table 1 Recovery rate of each step of the purification process of recombinant human DCD-1L

2.4 DCD-1L蛋白質(zhì)譜分析鑒定

如圖7所示，收集從分子篩S100洗脫下來(lái)的峰尾1和峰尾2，富集后用單四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，通過(guò)分子量信息快速鑒定化合物。由液相色譜圖可知，在2.792 min有一個(gè)極強(qiáng)吸收峰，后利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度，對(duì)于C，H，N，O組成的化合物，其通式為：CXHYNZOW，RI(M+1)/RI(M)*100=1.1x+0.37z和RI(M+2)/RI(M)*100=(1.1x)2/200+0.2w[31]，目標(biāo)化合物檢測(cè)預(yù)期最大分子量為4862 Da，與目的蛋白4.8 kDa，大小一致，表明該蛋白為重組DCD-1L蛋白。

圖7 重組蛋白DCD-1L LC-MS圖Fig.7 LC-MS map of recombinant DCD-1L

2.5 DCD-1L活性定性檢測(cè)

DCD-1L是從人體汗液中分離出來(lái)的一種天然活性多肽，在較廣的pH范圍和高鹽濃度下都具有抗部分細(xì)菌和真菌的活性[32]。由圖8可知，DCD-1L對(duì)大腸桿菌和表皮葡萄球菌均有抑菌作用，對(duì)表皮葡萄球菌抑菌活性更高。

圖8 DCD-1L對(duì)表皮葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)的抗菌活性Fig.8 activities of DCD-1L anti Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli

3 結(jié)論

盡管在2001年研究人員就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DCD-1L的抗菌特性，但在文獻(xiàn)中只有很少的構(gòu)建純化系統(tǒng)被報(bào)道。為數(shù)不多的生產(chǎn)和純化DCD-1L的方法均是基于融合蛋白的方式。本研究所構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)人源DCD-1L的異源可溶表達(dá)，通過(guò)建立穩(wěn)定的純化工藝，直接得到無(wú)需酶切的DCD-1L，最終得到的重組DCD-1L純度大于96%，可用于后期大量生產(chǎn)。本研究目前的一個(gè)局限性是缺乏對(duì)其他細(xì)菌和真菌抑菌活性的數(shù)據(jù)。因此，DCD-1L對(duì)鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌等病原菌的抑菌活性有待進(jìn)一步研究。接下來(lái)將進(jìn)一步研究對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性、最小抑菌濃度以及及抑菌機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)建立的DCD-1L異源表達(dá)體系更為簡(jiǎn)便，為其進(jìn)一步的理論和工業(yè)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。