金釵石斛多糖調控炎性小體NLRP3對非酒精性脂肪肝大鼠的保護作用

范艷 喻涓 楊榆青 何丹 姚政 宋波

摘要 目的：研究金釵石斛多糖對NAFLD大鼠的干預作用，并從NLRP3信號通路分析作用機制。方法：將72只SD大鼠分為正常、模型、金釵石斛多糖高、中、低劑量和多烯磷脂酰膽堿干預組，除正常組外，NAFLD模型構建成功治療4周后處死，取出肝臟檢測肝臟病理學和NLRP3、Caspase-1蛋白及mRNA表達，收集血液檢測谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-18（IL-18）含量。結果：正常組肝小葉清晰，細胞核分布均勻，模型組有明顯脂肪空泡和炎癥反應浸潤，金釵石斛多糖與多烯磷脂酰膽堿組明顯改善;與正常組比較，模型組AST、ALT、TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA均升高（P<0.05），與模型組比較，金釵石斛多糖組和多烯磷脂酰膽堿組上述指標均降低（P<0.05），此外金釵石斛多糖組與多烯磷脂酰膽堿組AST、ALT和HDL-C沒有差異，高劑量組TG、TC和LDL-C低于多烯磷脂酰膽堿組（P<0.05），中和高劑量組IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA明顯低于多烯磷脂酰膽堿組（P<0.05）。結論：金釵石斛多糖可明顯改善高脂高糖飲食誘導的NAFLD大鼠肝功能和血脂，這與其可調節(jié)炎性小體NLRP3，進而降低炎癥反應有關。

關鍵詞 金釵石斛多糖;非酒精性脂肪肝;大鼠;血脂;炎癥介質;炎性小體;NOD樣受體蛋白3;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

Protective Effects of Dendrobium Nobile Polysaccharide on NLRP3 in Rats with Nonalcoholic Fatty Liver Disease

FAN Yan1，2，YU Juan3，YANG Yuqing2，HE Dan2，YAO Zheng2，SONG Bo2

（1 School of Basic Medicine，Kunming Medical University，Kunming 650500，China; 2 School of Basic Medicine，Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650504，China; 3 School Hospital，Yunnan Normal University，Kunming 650500，China）

Abstract Objective：To investigate the intervention effect of Dendrobium nobile polysaccharides on NAFLD rats，and to analyze the mechanism of action from the NLRP3 signaling pathway.Methods：A total of 72 SD rats were divided into 6 groups，which were the normal，model，high dose，medium dose，low dose Dendrobium nobile polysaccharide，and the polyene phosphatidylcholine intervention group.Except for the normal group，the other 5 groups were constructed an animal model of NAFLD and after treatment，the rats were sacrificed.Their liver was taken out to detect liver pathology and NLRP3，Caspase-1 protein and mRNA expression.Their blood was also collected to detect the AST，ALT，TG，TC，LDL-C，HDL-C，IL-1β and IL-18.Results：The liver lobules in the normal group were clear，and the nuclei were evenly distributed.The model group had obvious fatty vacuoles and inflammatory reaction infiltration.The Dendrobium nobile polysaccharide and polyene phosphatidylcholine group improved significantly.Compared with the control group，AST，ALT，TG，TC，HDL-C，LDL-C，IL-1β，IL-18，Caspase-1 and NLRP3 protein and mRNA were significantly increased in the model group（P<0.05）.Compared with the model group，those indexes in the Dendrobium nobile polysaccharide and the polyene phosphatidylcholine group were significantly lower（P<0.05）.In addition，there was no difference in AST，ALT and HDL-C between the Dendrobium nobile polysaccharide group and the polyene phosphatidylcholine group.TG，TC and LDL-C of the high-dose group were lower than those of the polyene phosphatidylcholine group（P<0.05）.The protein and mRNA of IL-1β，IL-18，Caspase-1 and NLRP3 in the high-dose group were significantly lower than those in the polyene phosphatidylcholine group（P<0.05）.Conclusion：Dendrobium nobile polysaccharides can significantly improve the liver function and blood lipids of NAFLD rats induced by a high-fat and high-sugar diet，which is related to its ability to regulate the inflammasome NLRP3，thereby reducing the inflammatory response.

Keywords Dendrobium nobile polysaccharide; Nonalcoholic fatty liver disease; Rat; Blood lipids; Inflammatory factors; Inflammasome; Nod-like receptor protein-3（NLRP3）; Caspase-1

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.007

有研究顯示，當前非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）在我國發(fā)病率逐年升高，目前國內約有1.5億NAFLD患者，已經超過病毒性肝病，成為發(fā)病率最高的肝臟疾病[1]。NAFLD病理學主要表現(xiàn)為肝臟過度脂肪蓄積，進而引起肝細胞實質脂肪變性[2]。本病發(fā)生后需積極控制，若控制不佳，有很大概率可隨病情進展發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝功能衰竭或肝癌等[3]。因此對本病的積極防治特別重要。目前臨床中對于本病的治療，西藥以降糖、降脂和提高抗氧化能力以及消炎為主[4]，但治療效果欠佳。金釵石斛多糖是中藥金釵石斛最主要的有效藥理成分之一，作為我國九大仙草之首，石斛在抗癌、消炎、抗氧化等多方面均呈現(xiàn)出較好的效果[5]，其是否對NAFLD有治療作用還缺少相關研究證實，為此本研究成功復制了NAFLD模型，從炎性小體NLRP3途徑探討金釵石斛多糖對其的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠72只，體質量160～180 g，由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK-（云）2011-004]，大鼠在購買后飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，飼養(yǎng)條件按照國際標準，其中濕度40%～60%，溫度22～26 ℃，光照/黑暗（12 h/12 h），日常由其自由飲水，此外普通飼料和高脂飼料也由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心配置并提供。

1.1.2 藥物 金釵石斛多糖（純度98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，生產批號：180317）;多烯磷脂酰膽堿[賽諾菲（北京）制藥有限公司，生產批號：180122];戊巴比妥（上海信裕生物科技有限公司，生產批號：170821）;多聚甲醛溶液（淄博齊星化學科技有限公司，生產批號：180906）。

1.1.3 試劑與儀器 蘇木精-伊紅（HE）染料（廣州晶欣生物科技有限公司，貨號：JX078）;BCA蛋白定量試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，貨號：SK3021）;PVDF膜（Sigma公司，美國，貨號：IPVH00010）;ECL超敏發(fā)光試劑盒（江蘇碧云天生物公司，貨號：P0018FS）;β-肌動蛋白抗體（Actin抗體，貨號：W025-1-1）、天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate Aminotransferase，AST，貨號：C010-2-1）和丙氨酸氨基轉移酶（Alanine Aminotransferase，ALT，貨號：C009-2-1）購自南京建成生物工程研究所;血清白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6，貨號：CSB-E04640r）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α，貨號：CSB-E11987r）購自武漢華美生物工程有限公司;NOD樣受體蛋白3（Nod-like Receptor Protein-3，NLRP3，貨號：sc-365202）和天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase1，Caspase-1，貨號：56036）抗體購自美國Santa cruz公司;引物由上海生物生工設計并生產。酶標儀（北京普天新橋技術有限公司，型號：PT-3502）;分光光度計（上海精密科學儀器有限公司，型號：752N）;光學顯微鏡（上海光學儀器廠，型號：XSP-9CA）;石蠟切片機（徠卡，德國，型號：EM UC7）;梯度脫水機（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號：PPDT-12C1）;蛋白電泳儀（伯樂，美國，型號：Mini-PROTEAN Tetra）;實時熒光定量PCR儀（應用生物系統(tǒng)公司，美國，型號：StepOne TM）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有大鼠在購買后即稱重后按照體質量大小分組，分為正常組、模型組、陽性藥物多烯磷脂酰膽堿組、金釵石斛多糖高劑量組、金釵石斛多糖中劑量組、金釵石斛多糖低劑量組，分組后適應性喂養(yǎng)1周（只給予普通飼料，自由飲水），1周后，正常組仍給予普通飼料，其余5組則給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時間共8周，8周后檢驗造模是否成功（每組各取2只大鼠處死，肝臟HE染色肝臟有明顯脂肪空泡浸潤則證明造模成功）。

1.2.2 給藥方法 造模成功后，多烯磷脂酰膽堿組給予23 mg/kg多烯磷脂酰膽堿治療，給藥1次/d（給藥時將多烯磷脂酰膽堿溶于2 mL生理鹽水中），金釵石斛多糖高、中和低劑量組分別給予金釵石斛多糖200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg劑量治療，給藥1次/d（給藥時將金釵石斛多糖溶于2 mL生理鹽水中），正常組和模型組則給予生理鹽水2 mL灌胃治療，用藥4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 血清生化指標檢測 三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的測定交由云南省第三人民醫(yī)院完成，檢測儀器為全自動生化分析儀，結果自動導出。谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）檢測的測定嚴格按照試劑盒提供的說明書進行，采用比色法;白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-18（IL-18）檢測的測定嚴格按照試劑盒提供的說明書進行，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）。

1.2.3.2 肝臟組織病理學檢查 采用HE染色觀察肝臟組織病理學，制作時將肝臟從4%的多聚甲醛溶液中取出，自來水反復沖洗24 h，脫水干燥后、包埋、切片、常規(guī)HE染色即完成，中性樹脂封片后用帶有照相功能的顯微鏡觀察即可，每個組織隨機選取4個不同的視野。

1.2.3.3 蛋白表達檢測方法 根據(jù)試劑盒說明書，用組織裂解液將肝臟組織充分裂解后離心，對其上清液定量，完成后根據(jù)BCA試劑盒提供的說明書，測定蛋白含量并將其調平，然后每組各取50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后常規(guī)轉模、脫脂牛奶封閉、一抗過夜孵育（NLRP3（1∶3 000），Caspase-1（1∶2 000），β-actin（1∶5 000）孵育后洗滌，加入二抗（1∶5 000）孵育，最后暗室曝光洗片即可，結果以檢測蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值表示，每組實驗重復3次。

1.2.3.4 mRNA檢測方法 根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作，提取總RNA后，將其逆轉錄成cDNA，每組各取1 μL對其進行定量調平，然后每組取2 μg行QT-PCR擴增反應，擴增條件為95 ℃ 2 min、94 ℃10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 40 s，循環(huán)次數(shù)36次。分析方法選用2-△△Ct法，引物序列：NLRP3為F：ATCAACAGGCGAGACCTCTG，R：GTCCTCCTGGCATACCATAGA，產物長度：96 bp;Caspase-1為F：AATACAACCACTCGTACACGTC，R：AGCTCCAACCCTCGGAGAAA，產物長度：78 bp;β-actin：F：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，R：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT，產物長度：154 bp，每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。經檢驗所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，多組間比較采用F檢驗，2組之間比較采用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 金釵石斛多糖對NAFLD大鼠一般狀態(tài)的影響? 在整個實驗過程中，正常組大鼠精神和活動量正常，毛色順滑發(fā)亮，飲食和大小便也沒有異常，模型組則出現(xiàn)明顯活動量降低，毛色發(fā)黃粘連，飲食在造模期較正常組高，在造模成功后相較于正常組有一定減少，大便糖稀明顯發(fā)臭，與模型組比較，金釵石斛多糖3個劑量組和多烯磷脂酰膽堿組上述癥狀均有一定改善，此外各組大鼠均無死亡。

2.2 金釵石斛多糖對NAFLD大鼠血清生化指標的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝功能指標AST和ALT、血脂指標TG、TC、HDL-C和LDL-C均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與模型組比較，金釵石斛多糖3個劑量組和多烯磷脂酰膽堿組肝功能指標AST和ALT、血脂指標TG、TC、HDL-C和LDL-C均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），此外金釵石斛多糖3個劑量組與多烯磷脂酰膽堿組AST、ALT和HDL-C比較，差異無統(tǒng)計學意義，而金釵石斛多糖高劑量組血脂指標TG、TC和LDL-C均明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、表2。

2.3 金釵石斛多糖對NAFLD大鼠血清IL-1β、IL-18的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清炎癥介質指標IL-1β和IL-18明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），相較于模型組，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖3個劑量組IL-1β和IL-18均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，金釵石斛多糖中劑量和高劑量組IL-1β和IL-18明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 金釵石斛多糖不同給藥劑量對大鼠肝臟組織病理學的影響 大鼠肝臟病理學可見，正常組肝小葉結構清晰，肝細胞無脂肪變性，細胞核清晰分布于細胞中心;模型組大鼠則出現(xiàn)明顯的脂肪脂滴浸潤，細胞結構破壞，肝小葉不清晰，肝細胞腫脹，同時細胞核明顯受到擠壓，多烯磷脂酰膽堿和金釵石斛多糖3個劑量治療后，上述癥狀均有不同程度的改善，脂肪顆粒明顯減少，肝小葉清晰。見圖1。

2.5 金釵石斛多糖對大鼠肝臟細胞蛋白Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA表達的影響 模型組大鼠Caspase-1和NLRP3蛋白及mRNA表達相對于正常組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），金釵石斛多糖低、中、高劑量和多烯磷脂酰膽堿組相對于模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外金釵石斛多糖中劑量組和高劑量組明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2，表4。

3 討論

當前關于NAFLD的發(fā)生機制還沒有完全明顯，脂代謝異常、脂質過氧化、胰島素抵抗、遺傳、激素使用不當、環(huán)境和藥物不良反應等均可能參與了本病的發(fā)生或發(fā)展[6-7]。1998年，Day等[8]將多種因素整合認為NAFLD的發(fā)病機制為“二次打擊學說”。二次打擊學說認為，第一次打擊主要是由于胰島素抵抗所引起的肝臟脂肪過度堆積，而胰島素抵抗的發(fā)生核心又與人們日常高脂高糖飲食攝入增加密切相關;第二次打擊則主要是由于肝臟細胞受損，所引起的細胞內環(huán)境對肝細胞的自我傷害，這些因素包括氧化應激、脂質過氧化、炎癥反應等。由于實驗室的特殊性，模仿出一個和人類病理過程較為相似的動物模型對藥理學的開發(fā)具有積極的意義。本研究我們選用了較多的高脂高糖飲食所構建的NAFLD模型[9-10]，本模型可模擬出胰島素抵抗型的動物模型，此外相較于基因剔除小鼠，本模型重復性高，價格便宜。從研究結果中可以看出，正常組大鼠切片正常，而模型組則出現(xiàn)大量脂肪空泡，這證明了我們所構建的NAFLD模型是成功的，可以用于后續(xù)藥理學實驗的開發(fā)。

目前對于NAFLD的治療，國內外推薦采用有氧運動鍛煉法，但是最新的研究發(fā)現(xiàn)[11]，通過物理鍛煉雖可以有效的降低肝臟脂類和血脂含量，但是對于發(fā)生損壞的肝臟細胞是不可修復的，因此藥物的治療仍是需要的。對于NAFLD的西藥治療，目前主要采取的是針對病因對癥療法，通常給予的藥物主要有改善胰島素抵抗、提高抗氧化能力、降脂類藥物和抗細胞因子釋放藥物4類，但治療效果不佳，特別是預后較差的問題依然突出[12-13]。中醫(yī)藥在治療NAFLD方面也積累了大量的經驗，同時也形成了自己獨特的治療理念，以多糖類藥物為例，多糖類物質是生命活動必不可少的一類重要物質，植物體內的多糖類物質主要由多個單糖和其衍生物聚合所構成，近年來許多學者采用多糖類物質治療NAFLD[14-16]，效果較好。金釵石斛多糖是金釵石斛主要藥理活性成分之一，其在抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等方面均有較好的效果，此外其在降脂方面也有報道[17]。為此本研究采用金釵石斛多糖治療NAFLD大鼠，研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛多糖治療NAFLD后，大鼠肝臟病理學明顯好轉，肝功能明顯改善，血脂明顯改善，這提示金釵石斛多糖可以用于NAFLD的治療。

炎性小體近年來研究較廣，其在NAFLD、糖尿病腎病以及心肌損傷方面均有報道[18-19]。炎性小體主要功能為參與免疫防御，當細胞在受到外界因素刺激或細胞受到感染后，其可激活Caspase-1蛋白，而Caspase-1蛋白的激活和分泌的增加又可以進一步自我激活并誘發(fā)炎癥介質IL-1β和IL-18的釋放，以起到對機體的保護作用[20]。炎性小體種類較多，目前研究較多的主要為LRP1、IPAF、NLRP3和AIM等，其中NLRP3研究最為廣泛，此外NLRP3可參與多種代謝性疾病和多種免疫性疾病，包括多發(fā)硬化、動脈粥樣硬化、中風、老年癡呆等都是其的范疇[21]。目前關于NAFLD和NLRP3與NAFLD的研究也有報道[22]。本研究采用金釵石斛多糖治療NAFLD大鼠，考察對NLRP3和Caspase-1蛋白及mRNA表達的影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，金釵石斛多糖可明顯降低NAFLD大鼠肝臟中NLRP3和Caspase-1的表達，此外降低趨勢好于目前臨床中常用的保肝藥物多烯磷脂酰膽堿，這進一步提示金釵石斛多糖對NAFLD具有明顯的調節(jié)作用。

綜上所述，金釵石斛多糖可明顯改善高脂高糖飲食誘導的NAFLD大鼠一般狀態(tài)、改善肝功能、調節(jié)血脂，同時減緩炎癥反應浸潤，其作用機制可能與金釵石斛多糖能夠促使炎性小體NLRP3的蛋白及mRNA表達降低，進而調控下游因子IL-1β和IL-18有關。

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（2019-07-06收稿 責任編輯：王明）