4種病原菌“單管一步法”PCR快速檢測方法的建立

潘雅君， 徐汪節(jié)， 彭麗娜， 喬中東， 王朝霞

（上海交通大學(xué)a.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；b.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

0 引 言

對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定期進(jìn)行微生物檢測是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)［1-3］。肺炎克雷伯桿菌（KlebsiellɑPneumoniɑe，K.pneumoniɑe）、金黃色葡萄球菌（Stɑphylococcusɑureus，S.ɑureus）、嗜肺巴斯德桿菌（Pɑsteurellɑpneumotropicɑ，P.pneumotropicɑ）和綠膿桿菌（Pseudomonɑsɑeruginosɑ，P.ɑeruginosɑ）是SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠必須檢測和排除的項(xiàng)目［4］。這4種病原菌均屬于條件性致病菌，在動(dòng)物免疫功能低下等特定情況下引起感染，對于免疫系統(tǒng)受損的宿主影響較大，常表現(xiàn)為感染、炎癥甚至死亡［5-7］。從近年來國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果可以看出，這4種病原菌在實(shí)驗(yàn)小鼠中的感染率較高［8-12］，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，干擾試驗(yàn)結(jié)果。

中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測方法（GB14926）針對上述4種細(xì)菌推薦的檢測方法主要為分離培養(yǎng)和生化鑒定。但該方法通常需要3～7 d，操作煩瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也不適用于無法培養(yǎng)的微生物，檢測周期較長，對檢測人員專業(yè)技能要求較高［13-16］，不適用于對這4種細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行簡便、快速檢測。

近年來，分子檢測方法如質(zhì)譜（MS），聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP），高通量下一代測序（NGS）等迅速發(fā)展［14，17-18］。PCR方法可以快速準(zhǔn)確檢測樣品中的微生物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的多重PCR可以使用多對特異性引物同時(shí)檢測樣本中的多種病原體，但由于樣本中待檢測病原體的含量較低以及多種引物的干擾，往往導(dǎo)致一些非特異性片段在經(jīng)過30個(gè)PCR循環(huán)后出現(xiàn)條帶，影響檢測的準(zhǔn)確性［19-20］。

本文設(shè)計(jì)了一種基于16S rDNA序列的檢測思路，能夠通過一步PCR反應(yīng)同時(shí)檢測多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體。為避免多重PCR的缺點(diǎn)，將16S rDNA保守區(qū)的富集和16SrDNA特異性可變區(qū)檢測這兩個(gè)步驟整合為一步反應(yīng)，并選擇了肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌進(jìn)行檢測驗(yàn)證。結(jié)果表明多重巢式PCR（MN-PCR）方法靈敏度更高，在臨床樣本檢測中比多重PCR更加簡便，節(jié)省了時(shí)間和勞力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、肺炎克雷伯桿菌（ATCC 46117）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）購自廣東省微生物菌種保藏中心。綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。多殺巴斯德桿菌（ATCC 12945）基因組DNA、肺炎鏈球菌（ATCC 49619）、鼠傷寒沙門氏菌（SL1344）、大腸桿菌（CMCC 44102）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床檢測樣本。選取了4個(gè)經(jīng)第三方檢測機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果分別為肺炎克雷伯桿菌陽性，金黃色葡萄球菌陽性，嗜肺巴斯德桿菌陽性，綠膿桿菌陽性的小鼠咽拭子樣本。同時(shí)選取了39只不確定是否有細(xì)菌感染的待生物凈化小鼠，飼養(yǎng)在隔離包中，采集咽拭子樣本。

(3)引物。本研究中設(shè)計(jì)了一對通用引物：Universal Primers-F，Universal Primers-R（UP-F，UPR）和4對特異引物：K.pneumoniɑe-F，K.pneumoniɑe-R（KP-F，KP-R），S.ɑureus-F，S.ɑureus-R（SA-F，SA-R），P.pneumotropicɑ-F，P.pneumotropicɑ-R（PPF，PP-R），P.ɑeruginosɑ-F，P.ɑeruginosɑ-R（PA-F，PA-R）（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

(4)主要試劑。羊血瓊脂平皿購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；100 bp DNA Ladder購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×ES Taq Master Mix（Dye）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖和SYBR safe核酸染料購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)細(xì)菌基因組DNA提取。將所有菌株分別劃線接種于血瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落，接種于5 mL液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃有氧條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h，取1 mL菌液，嚴(yán)格按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取DNA模板于－20℃用于后續(xù)PCR檢測。通過細(xì)菌基因組DNA快速分離試劑盒提取模板DNA。

(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咽拭子樣本處理。采集小鼠的咽拭子樣本并將其浸入1.5 mL無菌水中10 min，對咽拭子進(jìn)行吹打懸浮后分為兩部分進(jìn)行處理：將其中750μL接種培養(yǎng)按照1.2.（1）步驟提取基因組DNA；將剩余750μL在8 000 r／min下離心2 min，除去上清，加入15μL TE（Tris＋EDTA）緩沖液并充分混合作為PCR模板。

(3)MN-PCR方法特異性檢測。反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×ES Taq Master Mix（Dye）10μL；引物UP-F，UP-R各0.01μmol／L；特異性引物（KP-F，KPR，SA-F，SA-R，PP-F，PP-R，PA-F和PA-R）各0.15 μmol／L；模板DNA各1 ng。

鹿科屬于偶蹄目，大多數(shù)雄鹿都長有角，這是雄性的象征。生活在北方的鹿，鹿角會(huì)在繁殖季節(jié)過后脫落，第二年再生出新的角。初長的角叫作“茸”，外面包裹著皮膚，角上有一層細(xì)細(xì)的絨毛，還有血管為新生的角大量供血。隨著鹿角慢慢長大，供血會(huì)逐漸停止，鹿角隨之干枯脫落。1—2歲小鹿的角是直直的，鹿角的分叉會(huì)隨著它們年齡的增長而增多，直到成年才會(huì)定型。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

(4)MN-PCR方法在4種病原體檢測中的靈敏度。MN-PCR反應(yīng)體系為20μL，模板DNA在體系中的終含量分別為：1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，10－1fg，10－2fg，10－3fg，10－4fg，體系中其他參數(shù)同1.2.（3）中所述。反應(yīng)條件同1.2.（3）中所述。

普通多重PCR反應(yīng)體系為20μL，包括：2×ES Taq Master Mix（Dye）10μL，特異性引物（KP-F，KPR，SA-F，SA-R，PP-F，PP-R，PA-F和PA-R）各0.15 μmol／L，模板DNA終濃度同上。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 MN-PCR方法在4種病原體檢測中的特異性

以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測中的一些常見細(xì)菌和相近菌株作為陰性對照來驗(yàn)證MN-PCR方法檢測的特異性，包括：肺炎鏈球菌，表皮葡萄球菌，多殺巴斯德桿菌，鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的4種特異性引物均能準(zhǔn)確擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶，而無法以對照細(xì)菌基因組DNA為模板擴(kuò)增出其他DNA條帶，有較好的特異性（見圖1）。

2.2 普通多重PCR與MN-PCR方法檢測單模板靈敏度比較

對MN-PCR和普通多重PCR方法的靈敏度進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在檢測單種細(xì)菌時(shí)2種方法的靈敏度有很大的差異，MN-PCR的靈敏度比普通多重PCR方法高10～100倍（見圖2）。

圖1 MN-PCR檢測方法的特異性

圖2 MN-PCR和普通多重PCR方法在單模板檢測中的靈敏度比較

2.3 MN-PCR方法對4種病原體的多重檢測能力

根據(jù)MN-PCR優(yōu)化條件，將4種待測細(xì)菌的基因組DNA按照：單細(xì)菌基因組，兩兩細(xì)菌混合基因組，三三細(xì)菌組合基因組以及四種細(xì)菌基因組，分別作為MN-PCR模板，驗(yàn)證了該方法的多重檢測能力。結(jié)果表明，單一模板和多種模板的PCR產(chǎn)物條帶均清晰可辨（見圖3）。

圖3 通過MN-PCR檢測四種細(xì)菌

2.4 MN-PCR方法同時(shí)檢測4種病原體的靈敏度

驗(yàn)證了MN-PCR方法和多重PCR方法在同時(shí)檢測4種病原體時(shí)的靈敏度。結(jié)果表明，利用MN-PCR方法可以同時(shí)檢測出4種細(xì)菌的特異性條帶，靈敏度為10 fg，而多重PCR無法同時(shí)檢測出4種細(xì)菌（見圖4）。

圖4 MN-PCR和多重PCR方法在多種混合模板檢測中的靈敏度比較

2.5 MN-PCR方法在臨床樣本檢測中的應(yīng)用

為了評估該方法在實(shí)際樣本檢測過程中的應(yīng)用效果，選擇了部分確定陽性的臨床樣本，以及未知待檢39臨床樣本（樣品來源于39只待生物凈化小鼠），分別利用MN-PCR和多重PCR方法進(jìn)行了檢測，已確定陽性樣本檢測結(jié)果如圖5所示，與已知確認(rèn)陽性一致。同時(shí)，為了驗(yàn)證在某些極端情況下如SPF小鼠同時(shí)感染多種細(xì)菌時(shí)，MN-PCR方法是否能夠同時(shí)檢測臨床樣本中多種微生物，混合臨床樣本進(jìn)行MN-PCR方法檢測。結(jié)果顯示，MN-PCR方法能夠同時(shí)擴(kuò)增出2種細(xì)菌的目的條帶（圖5（a）～（d）），而傳統(tǒng)的多重PCR在以未經(jīng)培養(yǎng)的低模板濃度下無法擴(kuò)增出目的條帶（圖5（e））。

圖5 利用MN-PCR方法對臨床樣本進(jìn)行檢測

未知待檢的39份臨床樣本檢測結(jié)果如表2所示，MN-PCR在對未經(jīng)培養(yǎng)的臨床樣本進(jìn)行檢測時(shí)檢出率高于普通PCR方法，且與培養(yǎng)后PCR驗(yàn)證結(jié)果相同。

3 討 論

微生物檢測在非常多的領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用。傳統(tǒng)的檢測方法如對樣本進(jìn)行培養(yǎng)，對可疑菌落進(jìn)行分離純化和生化鑒定的操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以應(yīng)用于常規(guī)的大規(guī)模檢測。近年來，微生物檢測的方法也在不斷創(chuàng)新，PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步推動(dòng)其在微生物檢測中的應(yīng)用越來越廣。

表2 不同方法對39份臨床樣本中4種病原菌的檢出率

多重PCR可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，通常用于檢測樣本中的多種微生物，可以節(jié)省大量時(shí)間和精力，已被成功應(yīng)用于許多領(lǐng)域的微生物檢測中。但普通多重PCR很容易出現(xiàn)特異性和多重性檢測的矛盾。

為了克服普通多重PCR方法上述不足，在MNPCR方法中整合巢式PCR和多重PCR的優(yōu)點(diǎn)，來確保擴(kuò)增檢測的高靈敏度和特異性。以肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌4種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施常見細(xì)菌為例，在其16srDNA保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了一對通用引物并使用簡并堿基來避免差異位點(diǎn)的擴(kuò)增偏好，在首輪PCR中擴(kuò)增富集待測細(xì)菌的16srDNA全長序列，后續(xù)基于每種細(xì)菌16srDNA序列的可變區(qū)設(shè)計(jì)特異性檢測引物以擴(kuò)增不同片段長度的檢測產(chǎn)物（見圖6）。同時(shí)，為了將16srDNA序列保守區(qū)域的富集和特異區(qū)域的擴(kuò)增整合為一步PCR，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏，同時(shí)檢測多種微生物，采用如下設(shè)計(jì)策略：利用通用引物及特異性引物長度差異達(dá)到兩階段PCR退火溫度高低不同；控制通用引物及特異性引物濃度的高低，使得低濃度通用引物既可以發(fā)揮作用且產(chǎn)物（1 500 bp片段）在電泳凝膠中不顯示條帶，從而在富集16srDNA序列片段的同時(shí)不會(huì)干擾第2階段的特異性擴(kuò)增；此外，對兩個(gè)PCR階段的循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化來確定最終的反應(yīng)條件及體系。

圖6 MN-PCR整體效果示意圖

在實(shí)際臨床樣本的檢測中，糞便或咽拭子樣本中微生物種類非常復(fù)雜，包含細(xì)菌、病毒和其他物質(zhì)等。由于樣品中待檢測細(xì)菌含量低和存在雜質(zhì)的影響，通常很難直接作為PCR檢測的模板。普通多重PCR方法通常需要較高的模板濃度，在檢測前需要對微生物進(jìn)行培養(yǎng)富集，這是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程，并且會(huì)增加污染的可能性從而導(dǎo)致潛在的假陽性。而MN-PCR方法由于具有較高的靈敏度，無需培養(yǎng)富集即可直接對樣本中的微量細(xì)菌進(jìn)行檢測。與培養(yǎng)后的臨床樣本檢測結(jié)果相比，MN-PCR方法具有較好的準(zhǔn)確性，大大縮短檢測時(shí)間和成本，減少了工作量，做到快速準(zhǔn)確。因此，NM-PCR方法可以快速大量檢測臨床樣本，在環(huán)境水源、臨床診斷、食品等領(lǐng)域的微生物檢測中具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

實(shí)踐告訴我們，偉大事業(yè)都成于實(shí)干。新時(shí)代是奮斗者的時(shí)代。新時(shí)代是在奮斗中成就偉業(yè)、造就人才的時(shí)代。我們要激勵(lì)更多科學(xué)大家、領(lǐng)軍人才、青年才俊和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)勇立潮頭、銳意進(jìn)取，以實(shí)干創(chuàng)造新業(yè)績，在推進(jìn)偉大事業(yè)中實(shí)現(xiàn)人生價(jià)值，不斷為實(shí)現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的中國夢奠定更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)、作出新的更大的貢獻(xiàn)。

——2019年2月20日，習(xí)近平在會(huì)見探月工程嫦娥四號任務(wù)參研參試人員代表時(shí)講話