雞毒支原體與雞安卡拉病毒混合感染病例的實驗室診斷

李 梅，楊 鵬，岳 筠，宋 春，成虹松，陳 靜 ，尹德晶，張雙翔*，程振濤*，李鳳龍

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008；3. 遵義市紅花崗區(qū)海龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 遵義 563000)

2020年10月，貴州省銅仁市某蛋雞場雞群出現(xiàn)零星死亡，幾天后死亡數(shù)量急劇增加，在7天內(nèi)死亡1 000余只，死亡率達21%。經(jīng)調(diào)查，該場發(fā)病蛋雞主要為11月齡；剖檢病死雞可見心包內(nèi)充滿淡黃色液體，肝臟充血腫大，喉頭出血。為了查明病因，特進行實驗室病原學(xué)檢測診斷，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測病料無菌采集該場3只病死雞的心臟、肝臟、脾臟、氣管、腦組織作為檢測病料。

1.2 主要試劑新城疫病毒(NDV)實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測試劑盒、禽流感病毒(AIV)通用型實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒(購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司)；2×TaqPCR MasterMix(購自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker(購自大連寶生物工程有限公司)；鮮血瓊脂培養(yǎng)基(自制)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器實時熒光定量PCR儀(bio-rad CFX connect，購自美國bio-rad公司)、多功能梯度PCR儀(VeritiTM96-Well Thermal Cycler，購自ABI公司)。

1.4 細菌分離培養(yǎng)無菌條件下取采集的肝臟、心臟、脾臟組織樣品(鮮樣)，分別劃線接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.5 組織樣品DNA/RNA提取分別取3只雞的心臟、肝臟、脾臟、氣管、腦組織病料各1 g于滅菌研缽中，加入生理鹽水1.5 mL快速研磨，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA試劑盒按說明書方法于室溫環(huán)境提取總DNA/RNA。

1.6 相關(guān)病原核酸檢測

1.6.1 NDV核酸檢測以提取的總RNA為模板，構(gòu)建 qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL：無菌無核酸酶水2.6 μL，qRT-PCR反應(yīng)液10 μL，酶混合液0.4 μL，熒光探針2.0 μL，模板RNA 5 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循環(huán)第2步(60 ℃ 35 s)收集熒光，共40個循環(huán)。根據(jù)試驗成立標(biāo)準(zhǔn)，以陽性對照Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，且陰性對照無Cq值作為實驗成立判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.2 AIV核酸檢測以提取的總RNA為模板，構(gòu)建 qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL： 無菌無核酸酶水2.8 μL，qRT-PCR反應(yīng)液10 μL，酶混合液0.4 μL，熒光探針1.8 μL，模板RNA 5 μL。反應(yīng)條件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循環(huán)第2步(60 ℃ 35 s)收集熒光，共40個循環(huán)。根據(jù)試驗成立標(biāo)準(zhǔn)，以陽性對照Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，且陰性對照無Cq值作為實驗成立判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.3 雞安卡拉病毒(FAdV-4)核酸檢測以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。引物序列：FAdV-4-F：5’-CCCAAGCTTATGTCGGCCCTA ATCGCCT-3’；FAdV-4-R：5’-TGCTCTAGAGGC CAAAGTATCGTCATCGATGAGCAG-3’；Tm值61 ℃。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳(110 V 30 min)，凝膠成像儀上觀察結(jié)果(預(yù)擴增片段366 bp)。

1.7 雞毒支原體(MG)核酸檢測以提取的總DNA為模板，構(gòu)建PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：MG-F：5’-ATG AAAGCTAGTATCTATAAA-3’；MG-R：5’-TTATCTT TGGTTGTTAAATTCAG-3’；Tm值56 ℃。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(110 V 30 min)，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴增片段639 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果3只病死雞組織樣品在鮮血瓊脂培養(yǎng)基中均無菌落生長，表明無細菌感染。

2.2 相關(guān)病原核酸檢測結(jié)果

2.2.1 NDV核酸檢測由圖1可見：陽性對照Cq值為25，3個檢測樣品均無明顯擴增曲線和Cq值，提示組織樣品中不存在NDV感染。

+：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖1 NDV qRT-PCR檢測結(jié)果

2.2.2 AIV核酸檢測由圖2可見：陽性對照Cq值為27，而3個檢測樣品Cq值均為0，且無明顯擴增曲線，提示組織樣品中不存在AIV感染。

+：陽性對照； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品圖2 AIV qRT-PCR檢測結(jié)果

2.2.3 FAdV-4核酸檢測由圖3可見：3個檢測樣品PCR均擴增出366 bp目的基因片段，與陽性對照相符，提示組織樣品中存在FAdV-4感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品； +：陽性對照圖3 FAdV-4 PCR檢測結(jié)果

2.3 MG核酸檢測由圖4可見：3個檢測樣品中有1個樣品PCR擴增出639 bp目的基因片段，與陽性對照相符，提示1 個組織樣品中存在MG感染。另外2個樣品中無MG感染。

M：2 000 bp分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； -：陰性對照； 1～3：檢測樣品； +：陽性對照圖4 MG PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論

通過對3只病死雞采集病料進行細菌分離鑒定和相關(guān)病原核酸檢測，確診該蛋雞場病例存在雞毒支原體與雞安卡拉病毒混合感染。建議該蛋雞養(yǎng)殖場用抗病毒藥物聯(lián)合抗支原體藥物控制疫情，并做好相關(guān)無害化處理及凈化工作。

4 討論

近年來，貴州省蛋雞產(chǎn)業(yè)在相關(guān)政策的大力扶持下得以迅速發(fā)展，但由于發(fā)展過程中飼養(yǎng)管理、生產(chǎn)技術(shù)、疫病防控、環(huán)境污染等問題，致使蛋雞疫病不斷發(fā)生且多種疫病混合感染日趨嚴重。常見的病原有禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、安卡拉病毒(FAdV-4)，雞毒支原體(MG)、滑液囊支原體(MS)等[1，2]。雞毒支原體病是由MG引起的1種慢性呼吸道傳染病，以發(fā)生呼吸道癥狀為主，病程長，病死率低，但可致幼雞生長緩慢，蛋雞產(chǎn)蛋下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[3，4]。雞安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ 群 C種血清4型(FAdV-4)引起的以心包積液、肝臟腫大出血為主要特征的疾病，又稱心包積液-肝炎綜合癥[5]。2015年以來，全國各地關(guān)于雞心包積水綜合征(安卡拉病)的病例報道陸續(xù)增多，傳染性強，死亡率高，給養(yǎng)殖戶造成很大損失[6]。本次檢測也證實該病在我省存在，且為在蛋雞群中發(fā)生。此外本次檢測結(jié)果還表明蛋雞群存在雞毒支原體混合感染，需要加強該病的凈化工作。對于發(fā)生混合感染的雞群，臨床癥狀與病理變化復(fù)雜，因此雞場在發(fā)病初期就應(yīng)迅速送檢，通過實驗室檢測診斷盡快確診病因，對癥對因正確處理，以免延誤病情造成更大的損失。