江口蘿卜豬PPP3CA和PPP3R1基因的表達(dá)規(guī)律研究

吳 雪，張 繼，劉若余，胡 焱

(1. 貴陽市烏當(dāng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 560018； 2. 遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 遵義 563000；3. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)，又稱蛋白磷酸酶2B(Protein phosphatase 2B，PP2B)，是目前已知的唯一受Ca2+和鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶[1]，是由催化亞基(CnA)和調(diào)節(jié)亞基(CnB)構(gòu)成的1種異源二聚體[2，3]。CnA有3種亞型：CnAα、CnAβ、CnAγ，分別由PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC基因編碼；PPP3CC僅在睪丸中表達(dá)，PPP3CA和PPP3CB則廣泛分布于動物體內(nèi)各組織中，但PPP3CA的豐度顯著高于PPP3CB[4，5]。CnB在機(jī)體內(nèi)由PPP3R1和PPP3R2基因編碼，PPP3R1主要在骨骼肌中表達(dá)，而PPP3R2則主要在生殖系統(tǒng)中表達(dá)[6]?？梢妱游矬w內(nèi)CaN的主要編碼基因?yàn)镻PP3CA和PPP3R1。CaN的生理功能涉及到細(xì)胞生長發(fā)育、機(jī)體免疫應(yīng)答乃至神經(jīng)元的集合和活化等多種生命活動[7，8]。CaN于1979年首先在腦組織中被發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)和T淋巴細(xì)胞中含量也很豐富，心血管系統(tǒng)和骨骼肌、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟中均有存在，被認(rèn)為是生物體應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的中心調(diào)節(jié)蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CaN 在多種細(xì)胞增殖分化中(如骨骼肌再生)有重要作用，使得CaN在器官移植免疫方面也成為研究的熱點(diǎn)。此外CaN對肌纖維類型也有重要調(diào)控作用，而不同肌纖維類型組成又決定肉品質(zhì)的優(yōu)劣，因此CaN的編碼基因變異和基因表達(dá)必然對畜禽肉品質(zhì)有著重大的影響。本研究通過檢測CaN的2個主要編碼基因PPP3CA和PPP3R1在江口蘿卜豬不同月齡和組織中的表達(dá)情況和規(guī)律，為鑒別影響肉質(zhì)的主效基因和挖掘良好的分子育種標(biāo)記提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物選取0、2、4、10月齡的江口蘿卜豬各3頭，屠宰后取脾、腎、肺、肝、心、胃、十二指腸、腰大肌、背最長肌9個組織，生理鹽水沖洗后立即放入裝有RNA保存液(RNA Protector)的凍存管中，置于 -80 ℃超低溫冰箱保存，用于提取RNA。

1.2 主要儀器超凈工作臺(型號BBS-H1500，山東博科)、PCR儀(型號PTC200，美國Bio-Rad)、超微量紫外分光光度計(jì)(型號NanoDrop ND-2000，美國Thermo)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號CFX96，美國Bio-Rad)。

1.3 主要試劑組織樣品RNA保存液(DP408，康為世紀(jì))、TRIzol(RNAiso Plus，日本 TaKaRa)、RNase-Free Water(北京索萊寶)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis(K1622，美國Thermo Fisher Scientific)、2×TaqMasterMix(康為世紀(jì))、iTaqUniversal SYBR Green Supermix(美國 Bio-Rad)。

1.4 總RNA提取采用TRIzol法分別提取0、2、4、10月齡江口蘿卜豬的心、肝、脾、肺、腎、胃、腰大肌、背最長肌、十二指腸9個組織的總RNA。 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，取RNA 2 μL 與10×loading buffer混合均勻，180 V電壓電泳15 min。

1.5 cDNA第一鏈合成用無RNA酶去離子水將提取的各組織總RNA濃度均稀釋至500 ng/μL，cDNA第一鏈合成反應(yīng)參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.6.1 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI登錄的豬PPP3R1(登錄號：XM_021087426.1)、PPP3CA(登錄號：NM_214128.1)基因mRNA參考序列，以及內(nèi)參基因β-actin，運(yùn)用primer premier 5軟件共設(shè)計(jì)3對特異性引物(為了提高引物特異性，引物均跨外顯子設(shè)計(jì))，均由生工生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.6.2 PCR反應(yīng)熒光定量PCR每個樣品做3個重復(fù)。(1)PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。繪制熔解曲線：95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，每10 s上升0.5 ℃。(2)PCR反應(yīng)體系20 μL：2×iTaqUniversal SYBR Green Supermix 10 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)熒光定量PCR系統(tǒng)內(nèi)置程序分析熒光定量PCR結(jié)果，其中加樣誤差超過0.5的樣品重做。導(dǎo)出數(shù)據(jù)，用2-△△Ct法計(jì)算PPP3R1、PPP3CA基因在各組織中的相對表達(dá)量，用單因素方差分析檢驗(yàn)各組基因表達(dá)量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取由圖1可見：28 S、18 S、5 S rRNA電泳條帶清晰明亮，且28 S條帶亮度是18 S的2倍，無拖尾和彌散，證明提取的RNA質(zhì)量高、完整性好。超微量紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示，總RNA濃度均在500 ng/μL以上，D260/280 nm值在1.8～2.0之間，說明RNA濃度純度均符合試驗(yàn)要求(大于2.0表明RNA有降解，小于1.8說明RNA存在蛋白質(zhì)殘留污染)，可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1：心； 2：肝； 3：脾； 4：肺圖1 RNA電泳圖譜

2.2 PCR擴(kuò)增由圖2可見：PPP3R1、PPP3CA基因以及內(nèi)參基因引物擴(kuò)增片段單一且清晰明亮，無明顯的拖尾和引物二聚體，對照DNA Marker可以看到片段大小與試驗(yàn)設(shè)計(jì)片段大小相符，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果，證明各引物特異性好，可用于下一步試驗(yàn)。

PPP3R1 PPP3CA β-actinM：DL 2 000 DNA Marker； 1：PPP3R1基因PCR擴(kuò)增片段； 2：PPP3CA基因PCR擴(kuò)增片段； 3：β-actin內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增片段圖2 各基因PCR擴(kuò)增

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖3、圖4、圖5：擴(kuò)增曲線基線平直，拐點(diǎn)清楚，整體平行性好，說明各個反應(yīng)管中擴(kuò)增效率相近，斜率大，擴(kuò)增效率高；Ct值在20～30之間，說明模板濃度適宜；熔解曲線呈現(xiàn)單一峰，熔解溫度在80～90 ℃之間，說明引物特異性好，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

圖3 PPP3R1基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線

圖4 PPP3CA基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線

圖5 β-actin基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線

2.4PPP3R1、PPP3CA基因組織表達(dá)差異

2.4.1 不同月齡PPP3R1表達(dá)量差異分析由圖6可見：除十二指腸外大部分組織中PPP3R1的表達(dá)較穩(wěn)定，不同月齡之間表達(dá)量差異不顯著。在背最長肌、十二指腸、胃、腰大肌中有隨月齡增加而上升的趨勢。10月齡時(shí)在十二指腸中的表達(dá)量顯著高于其他3個月齡，且2、4月齡顯著高于0月齡，有隨月齡增加而大幅上升的趨勢。10月齡時(shí)在腰大肌中的表達(dá)量顯著高于其他3個月齡。

圖6 PPP3R1基因在不同生長階段各組織中的表達(dá)注：圖柱中標(biāo)記不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或未標(biāo)記表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同

2.4.2 相同月齡不同組織中PPP3R2表達(dá)量差異分析由圖7可見：PPP3R1基因在腰大肌、背最長肌中的表達(dá)量最高，在4個月齡段中均顯著高于其他7個組織。在心臟中表達(dá)量最低，4個月齡段均顯著低于其他組織。在十二指腸、肺、肝、脾、腎、胃6個組織中均有不同程度的表達(dá)，除在2、4、10月齡十二指腸中的表達(dá)量均顯著高于腎以外，總體差異不顯著。

圖7 PPP3R1基因在相同生長階段各組織中的表達(dá)

2.4.3 不同月齡PPP3CA表達(dá)量差異分析由圖8可見：背最長肌、心、腰大肌中的PPP3CA表達(dá)量隨月齡增加而大幅上升。在背最長肌中的表達(dá)量2、4、10月齡差異不顯著，但均顯著高于0月齡；在心、腰大肌中的表達(dá)量為4月齡和10月齡顯著高于0月齡和2月齡，2月齡又顯著高于0月齡，可以看出PPP3CA表達(dá)量有隨著月齡增加上升幅度越來越小，逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢。在其他組織中的表達(dá)量除脾中有小幅上升趨勢以外，未見明顯隨月齡變化的規(guī)律。

圖8 PPP3CA基因在不同生長階段各組織中的表達(dá)

2.4.4 相同月齡不同組織中PPP3CA表達(dá)量差異分析由圖9可見：腰大肌、背最長肌、脾中PPP3CA表達(dá)量較高，均顯著高于其他組織，分別為背最長肌>腰大肌>脾。除腎臟中表達(dá)量較低(2月齡外的3個月齡均顯著低于其他組織)，以及心臟表達(dá)量0月齡時(shí)顯著低于其他組織之外，在其他組織中的表達(dá)總體差異不顯著。

圖9 PPP3CA基因在相同生長階段各組織中的表達(dá)

3 結(jié)論

PPP3CA和PPP3R1基因在腰大肌、背最長肌中的表達(dá)量最高，并且隨著月齡的增加而升高，說明PPP3CA和PPP3R1基因?qū)谔}卜豬腰大肌、背最長肌的生長發(fā)育有重要調(diào)控作用，由此推斷對其他骨骼肌的生長發(fā)育也有類似作用。

4 討論

4.1CaN作為參與動物多種細(xì)胞功能的重要調(diào)控因子，既可以介導(dǎo)活化T細(xì)胞核因子(NFAT)轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核，激活基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)纖維類型轉(zhuǎn)化，也可以通過Ca2+介導(dǎo)的CaN/SSH-cofilin調(diào)控通路參與調(diào)控的肌纖維生長發(fā)育和類型轉(zhuǎn)化[9，10]。CaN自身也可以作為信號分子，誘導(dǎo)Ⅰ型肌纖維特異基因啟動子活性上調(diào)，使Ⅱb和Ⅱx型肌纖維向Ⅱa和Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)化。因此，CaN的編碼基因PPP3R1和PPP3CA可以視為影響畜禽肉質(zhì)品質(zhì)的重要候選基因，但關(guān)于PPP3R1和PPP3CA基因結(jié)構(gòu)和變異的分析鮮見報(bào)道。

4.2本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPP3R1基因和PPP3CA基因表達(dá)規(guī)律大致相同，在個別組織中略有差異。在相同生長階段，腰大肌、背最長肌中PPP3R1基因和PPP3CA基因表達(dá)量均顯著高于其他組織，背最長肌和腰大肌中PPP3R1基因表達(dá)量差異不顯著，但背最長肌中PPP3CA基因表達(dá)量顯著高于腰大肌，這與Depreux E F和Wan L等[11，12]的研究結(jié)果一致。其原因是PPP3CA基因在快肌纖維中含量高于慢肌纖維，所以造成不同類型肌肉中表達(dá)存在一定的差異[13]。在心臟中PPP3R1基因表達(dá)量最低，4個月齡段均顯著低于其他組織，且隨月齡變化不大；而PPP3CA基因表達(dá)量隨月齡增加大幅上升，2月齡后與其他組織相當(dāng)。在十二指腸、肺、肝等6個組織中PPP3R1基因和PPP3CA基因均有不同程度的表達(dá)，除脾中PPP3CA基因表達(dá)量相對較高以外，總體表達(dá)規(guī)律差異不顯著。此外這2個基因在不同月齡江口蘿卜豬的大部分組織中表達(dá)較穩(wěn)定，只在背最長肌、腰大肌，以及其他個別組織中有隨月齡增加而上升，但隨著月齡增加上升幅度越來越小，逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢。推測可能是因?yàn)閯偝錾囊欢螘r(shí)間為生長發(fā)育最為迅速的時(shí)期，機(jī)體內(nèi)的酶和信號分子合成活躍，而隨著年齡增大逐漸趨于穩(wěn)定，處于動態(tài)平衡。PPP3R1基因和PPP3CA基因之間的表達(dá)差異可能是因催化亞基和調(diào)節(jié)亞基各自行使的生理功能不同所致，但具體原因還需要更深入的研究。