植物VIGS技術(shù)及其在林業(yè)科學(xué)中的研究進(jìn)展

高鵬飛 席飛虎， 張澤宇 胡凱強(qiáng) 陳凱 魏文桃 丁家治 顧連峰

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 基礎(chǔ)林學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)中心，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

最新一代的Nanopore納米孔測(cè)序技術(shù)和PacBio的異構(gòu)體測(cè)序（Iso-Seq）技術(shù)可便捷鑒定出長(zhǎng)片段的基因信息［1］，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛運(yùn)用在植物學(xué)研究之中［2］。由于測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，測(cè)序儀器更加便攜，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)大大縮短，所以不同植物物種的基因組序列信息也隨之激增［3］，包括銀白楊（Populus alba）［4］、挪威云杉（Picea abies）［5］、木麻黃（Casuarina equisetifolia）［6］等林木基因組被測(cè)序。雖然大規(guī)模高通量的基因序列已知，但相對(duì)應(yīng)的基因功能分析卻相對(duì)滯后，特別是確定林木物種基因功能仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，因此開(kāi)發(fā)對(duì)應(yīng)物種實(shí)用高通量的基因功能研究工具極為重要。

目前林木存在樹(shù)體高大、世代周期長(zhǎng)、外源基因表達(dá)困難等問(wèn)題［7］。利用植物穩(wěn)定過(guò)表達(dá)可以定向改造植物的遺傳特性在林木研究中雖已有應(yīng)用報(bào)道［8］，然而會(huì)受植物組織再生率、調(diào)控元件、轉(zhuǎn)化頻率等條件的限制，并且多數(shù)林木物種的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系較為困難，特別是在裸子植物針葉樹(shù)種中。化學(xué)誘變、輻射誘變、T-DNA插入、基因槍微彈轟擊等手段［9］都也可以引發(fā)植物基因功能的喪失或者整合外源基因，但這些技術(shù)難以做到高效特異性的靶向目的基因。針對(duì)以上兩種問(wèn)題使用VIGS可作為研究林木基因功能的一種快速有效的替代方案［10］，該技術(shù)與 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）都屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［11］。VIGS 利用了病毒侵染植物后引發(fā)RNA沉默，病毒被設(shè)計(jì)修飾后成為攜帶植物自身基因轉(zhuǎn)錄物的片段則會(huì)靶向降解該特定內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄本序列從而引發(fā)靶基因序列的特異性沉默達(dá)到研究該基因功能的目的［12-13］。簡(jiǎn)而言之，這是一種植物運(yùn)用自身特異性降解病毒基因組的先天防御途徑［14］所形成的反向遺傳學(xué)工具。早在1995年 Kumagai等［15］就將本氏煙（Nicotiana benthamiana）中八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturase，PDS）的cDNA片段置于煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）中，對(duì)本氏煙進(jìn)行侵染后葉片出現(xiàn)出了白化的表型并成功抑制了內(nèi)源PDS基因的表達(dá)。這種技術(shù)有望成為在林木物種中探究基因功能的利器。本文將系統(tǒng)綜述VIGS技術(shù)的機(jī)制和相關(guān)技術(shù)細(xì)節(jié)，同時(shí)著重討論VIGS在林木基因功能研究中的應(yīng)用。

1 VIGS機(jī)制

植物具有多層防御策略來(lái)防御病原體的傳播，可以在植物體單細(xì)胞和整個(gè)生物體水平上對(duì)抗病毒感染。病毒在傳播復(fù)制期間會(huì)形成的雙鏈RNA（double-stranded，dsRNA）從而觸發(fā)宿主的第一級(jí)防御反應(yīng)［16］。植物細(xì)胞內(nèi)的抗性蛋白核苷酸結(jié)合亮氨酸重復(fù)受體（nucleotide-binding leucine-rich repeat，NB-LRR）可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性［17］觸發(fā)第二級(jí)免疫策 略 ETI（effects Sub-triggered immunity）的啟動(dòng)，從而控制感染部位細(xì)胞的程序性死亡從而限制病原體在植株體內(nèi)的傳播。來(lái)自于病毒的感染性克隆被稱為病毒載體，靶基因與病毒載體相連接后將重組病毒載體侵染入植物細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)錄翻譯，植物開(kāi)啟自身第一級(jí)防御系統(tǒng)開(kāi)始VIGS進(jìn)程（圖1）。來(lái)自于病毒的RNA通過(guò)RNA依賴性RNA合成酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）形成了包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA［18］。dsRNA被宿主編碼的核酸內(nèi)切酶（dicer-like，DCL）蛋白識(shí)別，其中DCL4和DCL2蛋白直接參與RNA病毒防御系統(tǒng)［19］，DCL4是植物細(xì)胞中對(duì)病毒的主要防御者，抑制病毒在細(xì)胞間傳播對(duì)VIGS進(jìn)程起到了負(fù)調(diào)控作用，也是細(xì)胞內(nèi)VIGS開(kāi)始觸發(fā)的主要因素。DCL2可以促進(jìn)細(xì)胞間進(jìn)行基因沉默的信號(hào)因子擴(kuò)散，還能夠靶向降解植物細(xì)胞中的病毒RNA是VIGS體系中必不可少的一部分。DCL蛋白將dsRNA切割成21-24個(gè)核苷酸的小干擾 RNA（small interfering RNAs，siRNA）。由DCL蛋白產(chǎn)生的雙鏈siRNA被分離為單鏈siRNA加載到AGO（argonaute）蛋白上，將這些siRNA進(jìn)一步加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）上組成了效應(yīng)子復(fù)合物［20］，引導(dǎo)siRNA與植物內(nèi)源的的RNA靶向互補(bǔ)結(jié)合后通過(guò)核酸內(nèi)切酶對(duì)轉(zhuǎn)錄物的裂解來(lái)沉默RNA造成基因功能的喪失［21］。

2 VIGS研究方法

2.1 VIGS載體構(gòu)建流程

VIGS涉及3個(gè)主要過(guò)程：設(shè)計(jì)靶向沉默宿主基因片段與病毒基因載體進(jìn)行連接；以適當(dāng)?shù)姆椒ǜ腥局参锼拗?；植物進(jìn)行防御病毒機(jī)制沉默靶基因［22］。為了對(duì)較大的文庫(kù)進(jìn)行篩選，Liu等［23］建立了含有Gateway克隆位點(diǎn)的煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體，去除了冗長(zhǎng)的亞克隆步驟。VIGS載體構(gòu)建克隆的植物靶基因的片段通常為300-500 個(gè)堿基對(duì)（base pairs，bp）［24］，該長(zhǎng)度片段能夠有效的產(chǎn)生siRNA，短片段會(huì)降低沉默效率，而過(guò)長(zhǎng)的片段會(huì)增加沉默脫靶的可能性。插入序列的大小上限取決于病毒在細(xì)胞中的移動(dòng)快慢、病毒載體的大小、以及病毒在不同植物物種中的感染效率。在對(duì)煙草的研究結(jié)果顯示，即使是來(lái)自相同靶基因的不同區(qū)域的相似大小片段都可導(dǎo)致不同的沉默效率，本氏煙中200-1 300 bp的插入片段范圍內(nèi)都可以導(dǎo)致有效的基因沉默［25］。因此針對(duì)不同基因的VIGS實(shí)驗(yàn)都需考慮沉默目標(biāo)的靶基因區(qū)域。另外 應(yīng) 通 過(guò) BLAST（basic local alignment search tool）進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定構(gòu)建的基因片段是否具有特異性。靶基因目標(biāo)片段一般選擇在3′UTR區(qū)域的序列［25］，因?yàn)榛蛑羞@部分序列具有高度保守性，特異性的基因片段能夠?qū)е绿禺愋缘某聊?。?gòu)建載體時(shí)可以在病毒載體中插入多個(gè)基因片段以擴(kuò)大靶向范圍沉默不同的基因，Peele研究出使用番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus，TGMV）構(gòu)建的VIGS載體在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中共同沉默了鎂螯合酶亞基基因（magnesium chelatase subunit，SU）和增殖細(xì)胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）［26］。Turnage 等［27］構(gòu)建的白菜卷葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）VIGS載體也可在擬南芥中同時(shí)沉默CH42和PDS兩個(gè)基因。

圖1 VIGS分子機(jī)理Fig.1 Molecular mechanism of VIGS

2.2 VIGS接種侵染技術(shù)

TRV介導(dǎo)的VIGS是在雙子葉植物中使用最廣泛的VIGS體系之一，在較多的植物物種中都已經(jīng)成功侵染，并表現(xiàn)出較高的沉默效率。TRV載體研究本氏煙和番茄（Solanum lycopersicum）的VIGS技術(shù)相對(duì)較成熟［28］，將構(gòu)建好的病毒載體導(dǎo)入幼苗中，隨著植株的生長(zhǎng)，病毒從接種部位擴(kuò)散到植物的發(fā)育區(qū)域并開(kāi)始進(jìn)行PTGS過(guò)程?；虺聊蟊硇彤a(chǎn)生與病毒傳播的速度一致，輕微的病毒癥狀通常在接種7-10 d后開(kāi)始產(chǎn)生，在2-3周內(nèi)向植株新生的幼嫩葉片擴(kuò)散，通常在3周之后即可產(chǎn)生最易觀察的表型。針對(duì)不同植物種類和實(shí)驗(yàn)類型的研究目的，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種農(nóng)桿菌對(duì)植物接種侵染的不同方法。例如通過(guò)用牙簽挑選農(nóng)桿菌并將牙簽刺入幼苗葉片中就可以充分感染，對(duì)葉片、葉腋分生組織進(jìn)行注射滲透，真空滲透，或者用農(nóng)桿菌噴灑幼苗也都可以獲得良好的沉默效果［23，29］。使用農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染的方法還應(yīng)針對(duì)不同物種進(jìn)行開(kāi)發(fā)改進(jìn)，以及對(duì)病毒載體進(jìn)行改造，優(yōu)化接種技術(shù)。TRV這樣的二元病毒，其中PTRV1含有編碼RNA依賴性RNA聚合酶，運(yùn)動(dòng)蛋白和16K富含半胱氨酸蛋白的基因，PTRV2含有編碼外殼蛋白的基因和用于克隆目的基因的限制位點(diǎn)?；赥RV的VIGS載體需要PTRV1和PTRV2兩組分的混合共表達(dá)才可以發(fā)揮侵染作用。如以最廣泛使用的TRV載體為例展示了侵染技術(shù)路線（圖2）。

2.3 接種后植株的環(huán)境影響

植物生長(zhǎng)的外界壞境對(duì)病毒載體侵染植株的活性有直接影響［30］，在環(huán)境因素中溫度是影響病毒有效傳播的最重要因素之一。糧食作物多為單子葉植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。針對(duì)小麥（Triticum aestivum）感染病毒的最適溫度研究發(fā)現(xiàn)，其生長(zhǎng)的最佳環(huán)境溫度為15-20℃。中國(guó)小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）在低溫17℃下對(duì)小麥PDS基因的沉默效率達(dá)到了70%-84%從而產(chǎn)生了明顯的光漂白現(xiàn)象，而同樣溫度下大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）和狐尾花葉病毒（Foxtail mosaic virus，F(xiàn)oMV）并未造成任何的沉默表型［31］。高粱（Sorghum bicolor）感染雀麥草花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）后在溫度22℃下僅有10%的植株產(chǎn)生病毒感染癥狀［32-33］，對(duì)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行了環(huán)境溫度的改進(jìn)發(fā)現(xiàn)高粱接種BMV沉默載體后轉(zhuǎn)移至環(huán)境溫度為18℃溫室中生長(zhǎng)4周，植株出現(xiàn)基因沉默的表型為100%，顯著提高了VIGS實(shí)驗(yàn)的沉默效率［24］。因此在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)病毒適宜感染的溫度和觀測(cè)病毒感染起作用的時(shí)間都應(yīng)該進(jìn)行預(yù)先的實(shí)驗(yàn)探究［34］。

圖2 VIGS侵染技術(shù)示意圖Fig.2 Schematic diagram of VIGS infection technology

針對(duì)雙子葉模式植物本氏煙和番茄進(jìn)行基因沉默實(shí)驗(yàn)通常使用TRV體系，植株在20-22℃的溫室中生長(zhǎng)3周就可以產(chǎn)生明顯的白化表型［35］，然而在對(duì)番茄基因沉默體系進(jìn)行改進(jìn)時(shí)發(fā)現(xiàn)在低溫15℃環(huán)境時(shí)番茄葉片、花朵、果實(shí)中的PDS基因的轉(zhuǎn)錄本水平發(fā)生了更顯著的降低，葉綠素含量降低了90%以上［36］。雙子葉植物通常使用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化效率高低取決于環(huán)境溫度條件與農(nóng)桿菌病原體之間的相互作用能否促成細(xì)胞外菌毛（etracellular pilus，T-pilus）的形成。Vir（virulence）基因的大量表達(dá)可促進(jìn)T-pilus形成，它由VirA和VirG兩部分控制，高于28℃的溫度會(huì)抑制T-pilus的形成，并降低Vir蛋白的穩(wěn)定性溫度，超過(guò)32℃會(huì)導(dǎo)致VirA磷酸活化功能的喪失從而降低Vir基因的表達(dá)［37］，因此不耐高溫的農(nóng)桿菌株系無(wú)法在高于28℃情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)化［34］。實(shí)驗(yàn)探索過(guò)程中必須在確定接種病毒的最佳方式以及維持植物良好的生長(zhǎng)條件方面投入巨大的時(shí)間和人力成本。對(duì)于特定植物和病毒載體均有最佳溫度范圍來(lái)使病毒侵染并在植物體內(nèi)傳播，因此在環(huán)境溫度可控的人工氣候室中進(jìn)行VIGS實(shí)驗(yàn)有助于獲得良好且可重復(fù)的的穩(wěn)定侵染效率。

2.4 VIGS的實(shí)驗(yàn)對(duì)照和沉默效果的評(píng)估

每個(gè)VIGS實(shí)驗(yàn)中都要進(jìn)行沉默有效性的檢測(cè)。常見(jiàn)的陽(yáng)性對(duì)照是針對(duì)PDS基因和ChlH（chelatase subunit）基因進(jìn)行的沉默［38-39］，會(huì)產(chǎn)生明顯的葉片變白表型。使用馬鈴薯X病毒（potato virus x，PVX）載體針對(duì)在光合作用第二階段中參與葉綠體類囊體發(fā)育的Ftsh（filamentation temperaturesensitive H）基因沉默后同樣也使本氏煙產(chǎn)生了白化表型［40］。在本氏煙和茄子（Solanum melongena）中也有針對(duì)SU基因沉默作為陽(yáng)性對(duì)照［41-42］，植株葉片變黃產(chǎn)生了黃色斑點(diǎn)。這些基因都參與植物的光合作用，特異性沉默后可以使植株沉默區(qū)域產(chǎn)生最容易看見(jiàn)的光漂白表型。但是根據(jù)不同物種的特性也需要進(jìn)行適時(shí)的改進(jìn)，如果病毒感染所產(chǎn)生的表型與沉默PDS或ChlH所產(chǎn)生的白化表型比較相似的話，針對(duì)白化基因的沉默就不是衡量VIGS實(shí)驗(yàn)是否成功的視覺(jué)標(biāo)簽，所以為了解釋可能由于病毒本身引起的表型變化，在植物中接種不含目的基因的空載作為陰性對(duì)照是極為必要的。在對(duì)高粱基因沉默時(shí)針對(duì)植物發(fā)育的關(guān)鍵蛋白泛素基因（Ubiquitin，Ubiq）構(gòu)建了載體作為陽(yáng)性對(duì)照，沉默后使植株葉片產(chǎn)生了褐變的可變表型，因此沉默Ubiq就是高粱的最佳視覺(jué)標(biāo)記基因［24］。

VIGS技術(shù)沉默基因的效率和特異性需要通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）來(lái)進(jìn)行確認(rèn)各種組織中基因的表達(dá)量和不同樣品實(shí)驗(yàn)處理間基因表達(dá)的差異。實(shí)時(shí)定量RT-PCR在實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中應(yīng)該注意以下因素：提取高質(zhì)量的RNA，有效去除DNA的污染，設(shè)計(jì)的引物無(wú)引物二聚體［43］。RTPCR引物設(shè)計(jì)的區(qū)域應(yīng)該確保位于靶基因轉(zhuǎn)錄本的區(qū)域，但是要處于VIGS載體中克隆的序列之外區(qū)段，并且要確保特異性而非來(lái)自其他相似同源的基因［22］。

3 VIGS相關(guān)的軟件工具

植物在PTGS期間存在有基因沉默脫靶的高風(fēng)險(xiǎn)，VIGS實(shí)驗(yàn)的成功需要確保靶基因的高度特異性，以及較高的沉默效率?，F(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出許多軟件來(lái)輔助進(jìn)行預(yù)測(cè)VIGS沉默效率以及構(gòu)建VIGS載體（表1）。

4 VIGS在林木基因功能研究中的應(yīng)用

在生命周期較長(zhǎng)的多年生木本植物中，較長(zhǎng)的世代限制了遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，所以建立快速可靠的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)于木本植物尤為重要。隨著林木中第一個(gè)多年生木本植物毛果楊（Populus trichocarpa）的全基因組序列的完成［54］，針對(duì)林木特有的性狀例如木材形成，多年生生長(zhǎng)特性，季節(jié)性變化等這些在擬南芥和水稻這兩個(gè)模式植物無(wú)法解決的問(wèn)題上開(kāi)啟了新的研究領(lǐng)域［55］。由于病毒誘導(dǎo)的基因沉默具有實(shí)驗(yàn)步驟易于操作且產(chǎn)生表型所需的時(shí)間比較短等優(yōu)勢(shì)，VIGS已經(jīng)從以下不同的方面運(yùn)用在林木功能基因組學(xué)研究之中。VIGS系統(tǒng)在木本模式植物楊屬胡楊中及果樹(shù)、觀賞樹(shù)種中進(jìn)行的基因沉默研究結(jié)果總結(jié)參見(jiàn)表2。

4.1 林木物種中病毒載體的開(kāi)發(fā)建立

TRV載體在對(duì)林木物種中基因功能的探究中發(fā)揮了重要作用。與其他病毒相比TRV具有在植株中的傳播感染強(qiáng)，產(chǎn)生的病毒癥狀輕，可以更強(qiáng)烈降低基因的表達(dá)量等優(yōu)點(diǎn)［69］，因此TRV在林木物種中得到了廣泛的運(yùn)用。麻風(fēng)樹(shù)作為礦物資源和生物染料的替代來(lái)源，其種子中含油量高達(dá)30%，利用TRV載體對(duì)麻風(fēng)樹(shù)基因的高通量篩選后確定了其中脂肪酸合成、發(fā)育調(diào)控和自然毒素分泌3個(gè)功能相關(guān)的基因［57］。TRV載體還在經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的果樹(shù)中成功運(yùn)用，例如對(duì)桃子沉默ChlH基因，載體侵染桃樹(shù)幼苗葉子15 d后接種的區(qū)域就開(kāi)始褪色最后產(chǎn)生了白化葉片［61］，以及在對(duì)櫻桃樹(shù)調(diào)節(jié)花色苷合成途徑的MYBA基因沉默后生長(zhǎng)出缺少紅色素的櫻桃果實(shí)［62］。除此之外，TRV載體在抗逆性較強(qiáng)的林木物種中也被成功運(yùn)用，例如運(yùn)用VIGS技術(shù)在胡楊中沉默了PDS基因，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了溫度梯度對(duì)胡楊樹(shù)的侵染最適環(huán)境進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)在28℃時(shí)沉默效率最高［56］，使其葉片產(chǎn)生了光漂白的表型。因此使用TRV載體在較難穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的林木中的應(yīng)用具有較大前景。

表1 基因沉默相關(guān)設(shè)計(jì)軟件Table 1 Gene silence related design software

針對(duì)不同的林木物種應(yīng)該開(kāi)發(fā)建立特有的新病毒載體，以擴(kuò)大VIGS研究體系范圍，進(jìn)行最有效的基因功能研究。目前開(kāi)發(fā)林木物種中的VIGS載體工具已經(jīng)展開(kāi)并獲得了初步的成功。感染相對(duì)廣泛的蘋(píng)果潛伏球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）最初就是從蘋(píng)果樹(shù)中分離出來(lái)，它是一種直徑為25 nm的球形小病毒［70］，由兩組分單鏈RNA基因組（RNA1和RNA2）和3種不同的衣殼蛋白組成［71］。盡管蘋(píng)果樹(shù)是ALSV唯一的自然宿主，但是它可以通過(guò)人工接種去感染擬南芥、本氏煙、重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物（番茄、黃瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、蘋(píng)果、葡萄（Vitis vinifera）、柑橘（Citrus reticulata））等［72-74］，在這些物種中ALSV都可以導(dǎo)致有效的基因沉默。木薯是全球最重要的塊根作物之一，全球八億多人以它生長(zhǎng)產(chǎn)生的塊狀淀粉根為主食，盡管現(xiàn)在已有遺傳轉(zhuǎn)化方案，但是耗時(shí)較長(zhǎng)且方法困難，并且受到生命周期長(zhǎng)，雜合度高和近親衰退的限制［75］。基于木薯自身的非洲木薯花葉病毒（African cassava mosaic virus，ACMV）的VIGS載體可以快速高效地侵染木薯，針對(duì)PDS和標(biāo)記基因UidA（β-glucuronidase enzyme）沉默后在木薯葉子、纖維根、塊狀根等這些不同器官中可視化的觀察到基因沉默結(jié)果［29］，證明了VIGS可以高通量的分析木薯基因功能。

表2 VIGS系統(tǒng)在楊樹(shù)屬等林木物種中的研究應(yīng)用Table 2 Research and application of VIGS system in poplar and other forest tree species

4.2 林木物種中生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)和激素相關(guān)基因解析

VIGS在林木中生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)以及抗逆機(jī)制中的研究中具有重要意義。木質(zhì)部次生細(xì)胞壁的形成為生產(chǎn)生物乙醇提供了必要的原料，工業(yè)生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用的木材和纖維也主要由次生細(xì)胞壁組成。與擬南芥相比木本植物的次生細(xì)胞壁調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，因此了解木本植物中次生細(xì)胞壁形成的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控非常重要［76］。VIGS體系針對(duì)DUF579（domain unknown function 579）和 KNAT7（knotted-like homeobox of Arabidopsis thaliana 7）的基因沉默后，發(fā)現(xiàn)植株的細(xì)胞壁松弛，糖脂提取后顯示多糖提取率增加［77］，研究結(jié)果有助于深入了解木質(zhì)部纖維素的產(chǎn)生機(jī)制。VIGS在研究樹(shù)木韌皮部中運(yùn)輸mRNA等大分子快速響應(yīng)干旱脅迫機(jī)制也發(fā)揮了重要作用。梨樹(shù)嫁接到砧木上后，RNA測(cè)序分析顯示PbDRM（pyrus betulaefolia drought responsive mobile gene）轉(zhuǎn)錄本豐度顯著增加，RT-PCR檢測(cè)到PbDRM從砧木轉(zhuǎn)移到接穗上從而使接穗的抗旱性顯著增加。并且通過(guò)VIGS下調(diào)PbDRM發(fā)現(xiàn)增加了梨樹(shù)的干旱敏感性，證明了PbDRM作為干旱脅迫下梨樹(shù)韌皮部的移動(dòng)信號(hào)［60］。

木本植物的生長(zhǎng)與生長(zhǎng)素、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素等激素有著顯著的相關(guān)性。GA的合成過(guò)程中植物特有的發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵因子GRAS（GAI-RGA-and-SCR）蛋白質(zhì)家族發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并且GRAS在植物結(jié)構(gòu)中具有重要的調(diào)節(jié)效應(yīng)可促進(jìn)枝條的下垂［78］，針對(duì)不同生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)表型植物利用VIGS工具對(duì)GRAS基因功能的探究有助于深入了解結(jié)構(gòu)控制機(jī)制。紫薇有枝干直立和枝條矮化下垂的兩個(gè)品種，使用TRV載體針對(duì)枝條下垂品種紫薇的GRAS1基因進(jìn)行基因沉默，侵染15 d后發(fā)現(xiàn)下垂枝條出現(xiàn)了向上生長(zhǎng)的表型，其中一些樹(shù)枝的分枝角度甚至接近于直立品種分枝的角度，30 d后產(chǎn)生了更多的腋芽和更多畸形的分枝［68］。該研究解析了林木中枝干下垂的調(diào)控機(jī)制，為林木的根枝生長(zhǎng)和分層定位提供了重要基礎(chǔ)，在林木結(jié)構(gòu)水平上闡明了分子功能［79］。

5 VIGS在林木基因功能研究中的局限性以及解決方法

VIGS可導(dǎo)致對(duì)非靶基因的表達(dá)抑制，產(chǎn)生脫靶沉默現(xiàn)象，造成基因的沉默效率降低，這在缺乏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的林木物種中更容易發(fā)生。脫靶沉默取決于多方面的因素［80］，如靶基因的位置，dsRNA的長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)化侵染植物的方法是否合適，VIGS載體感染的效率等方面［25］。針對(duì)上述問(wèn)題在構(gòu)建VIGS載體時(shí)可以使用SGN，siRNA-Scan等軟件來(lái)選擇基因沉默區(qū)域并且評(píng)估PTGS過(guò)程中所產(chǎn)生的21nt siRNA 是否能夠發(fā)揮的功效［44，46］。Zhou 等［81］提出一種構(gòu)建載體的改進(jìn)方法，使用70 bp的基因片段其中包含來(lái)自3個(gè)不同基因相互不匹配的21 bp堿基的片段，使用這種改進(jìn)的方法可以減少VIGS的脫靶沉默現(xiàn)象并且特異性的敲除基因家族中的高度相似的成員。改進(jìn)載體的同時(shí)也應(yīng)該探索新的病毒誘導(dǎo)機(jī)制，Ossowski等［52］證明了卷心菜卷葉病毒（cabbage leaf curling virus，CaLCuV）和TRV在本氏煙中使用新開(kāi)發(fā)的微小RNA介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉 默（microRNA-based virus induced gene silencing，MR-VIGS）方法，也可以降低脫靶現(xiàn)象的產(chǎn)生［82］。

VIGS難以完全抑制靶基因表達(dá)，因此即使降低了靶基因的轉(zhuǎn)錄水平但仍然可以產(chǎn)生足夠的功能性蛋白，所以在沉默的植物中可能未觀察到表型，或者表型不明顯。并且如果僅病毒接種植物就可以改變植物表型［83］，那么由于基因沉默而導(dǎo)致的細(xì)微表型有可能被病毒癥狀掩蓋，因此對(duì)沉默表型的解釋會(huì)變的更加復(fù)雜化。許多病毒在增殖和傳播過(guò)程中會(huì)刪除插入的基因［84-85］，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)加入空載處理，有助于區(qū)分沉默基因所產(chǎn)生的表型和病毒載體誘導(dǎo)的癥狀［10］。

6 利用VIGS研究基因功能的優(yōu)勢(shì)以及未來(lái)前景

研究基因功能的最簡(jiǎn)單最有效的方法是減弱基因的表達(dá)或產(chǎn)生不編碼功能性蛋白質(zhì)的突變體。隨著植物全基因組序列的獲得，需要大規(guī)模分析來(lái)確定數(shù)千個(gè)基因的功能。VIGS是新興的植物功能基因組學(xué)工具之一，雖然有一定的不足但也避免了許多傳統(tǒng)功能分析方法的局限性［86］，在基因鑒定和功能分析方面具有巨大的潛力。VIGS具有的優(yōu)點(diǎn)以及在未來(lái)的前景方向主要包括以下幾個(gè)方面：

第一，VIGS不需要完善的參考基因組序列，只需要部分轉(zhuǎn)錄組序列的信息就可以對(duì)待研究的的目的基因造成基因沉默［87］。雖然現(xiàn)在高通量測(cè)序非常普及，但是很多林木類非模式物種依然沒(méi)有參考基因組序列，對(duì)于這種非模式物種的基因功能研究，VIGS明顯具有十分明顯的優(yōu)勢(shì)。

第二，VIGS不需要穩(wěn)定的植物遺傳轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)操作步驟簡(jiǎn)單。可以在植物生命周期內(nèi)的侵染短暫幾周后快速產(chǎn)生表型，因此在難以轉(zhuǎn)化的林木物種中基因功能的表征變得容易［22］。最近的研究表明，在植物在適當(dāng)?shù)臈l件下，VIGS在整個(gè)生命周期中可以進(jìn)行持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間高效的VIGS［88］，甚至可以持續(xù)數(shù)年直到植物死亡。大豆中ALSV介導(dǎo)的VIGS針對(duì)PDS基因進(jìn)行沉默后葉片出現(xiàn)了高度均勻的光漂白表型，并且在整個(gè)生命周期中穩(wěn)定的維持了VIGS。基因沉默傳播到20%-30%的種子中，所有基因沉默的種子生長(zhǎng)后的幼苗都表現(xiàn)出均勻的病毒感染癥狀和高沉默效率產(chǎn)生了白化表型［89］。到目前為止，VIGS 在植物激素代謝合成［90］、出苗活力［91］、花果實(shí)發(fā)育［92］、外界應(yīng)激非生物和生物脅迫［93］及衰老凋亡［94］等生命過(guò)程中的基因功能驗(yàn)證方面具有巨大潛力。特別是在那些難以進(jìn)行轉(zhuǎn)化且沒(méi)有廣泛收集突變體的林木物種中，VIGS是一種較為有效的研究基因功能的技術(shù)。

第三，針對(duì)具有高度同源性的基因家族進(jìn)行有效的特異性敲除?；蚣易逯械幕蚓哂邢嗨票Ｊ氐幕蚪Y(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域，通過(guò)將具有相同保守序列的兩個(gè)或多個(gè)基因家族成員沉默，可以破解大多數(shù)基因家族參與的調(diào)節(jié)植物激素信號(hào)傳導(dǎo)和逆境調(diào)控相關(guān)機(jī)制，以及植物中碳水化合物的合成、衰老、發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑［95］。真菌病原體（Setosphaeria turcica，ST）可以在玉米高粱葉片上引發(fā)葉枯病，是世界范圍內(nèi)的流行性病害，ST抗性基因家族中都具有CC-NB-LRR（coiled-coil nucleotidebinding site leucine-rich repeats）蛋白結(jié)構(gòu)域參與識(shí)別病原體啟動(dòng)植物的防御反應(yīng)。Martin針對(duì)ST基因家族中6個(gè)基因的共同區(qū)域設(shè)計(jì)了VIGS載體，沉默高粱后發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)基因的表達(dá)量均發(fā)生了下調(diào)，病菌侵染后沉默組的抗病性顯著下降，染病癥狀加劇，產(chǎn)生大量的真菌孢子［33］。因此VIGS在對(duì)基因家族中共同的特異性基因結(jié)構(gòu)域的沉默，可以破解脅迫相關(guān)的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)組分［96-97］，促進(jìn)了植物在多種脅迫下的基因功能研究。

第四，將病毒載體和最新的功能基因組學(xué)工具結(jié)合是著眼于當(dāng)前以及未來(lái)的可能發(fā)展方向［98］。植 物 中 CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced palindromic repeats）已經(jīng)成為另一種強(qiáng)大有力的編輯技術(shù)［98］。在編輯系統(tǒng)中高效的傳遞載體尤為重要，Ali研究報(bào)道稱TRV可以將引導(dǎo)RNA（guid RNA gRNA）傳遞到Cas9穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因本氏煙中，指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶至目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行精確切割，雖然效率較低但也檢測(cè)到了PCNA基因的靶向修飾［99］。Liu開(kāi)發(fā)了一種更強(qiáng)大的基于DNA病毒CaLCuV用于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的植物基因組編輯技術(shù)（virusbased genome editing，VIGE），精確地靶定 PDS和IspH基因引發(fā)突變，其編輯效率高達(dá)85%和75%并產(chǎn)生了白化表型。與TRV在細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄不同，CaLCuV可以在基因編輯的細(xì)胞核中復(fù)制并表達(dá)gRNA，所以顯示出了較高的基因編輯效率［100］。這擴(kuò)大了VIGS和CRISPER/Cas在植物基因組學(xué)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。

植物穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系中通常都需要植物組織培養(yǎng)和生成愈傷組織，并且林木物種中難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。尋找一種不需要組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法使后代依然保持著高突變是植物轉(zhuǎn)基因和基因編輯的主要方向。如果sgRNA可以進(jìn)入到生殖細(xì)胞中，則使用RNA病毒載體就能導(dǎo)致產(chǎn)生更高頻率的可遺傳基因編輯。在2020年6月Ellison等［101］開(kāi)發(fā)了一種植物體內(nèi)基因編輯的方法，使用TRV病毒攜帶著單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）感染進(jìn)Cas9的轉(zhuǎn)基因植物中，其中sgRNA與植物體內(nèi)的FT（flowering locus T）基因融合，F(xiàn)T基因可以在植物體內(nèi)葉維管束中轉(zhuǎn)錄后并轉(zhuǎn)移到莖尖分生組織誘導(dǎo)開(kāi)花，因此FT可以促進(jìn)sgRNA進(jìn)入莖尖分生組織并以較高的效率產(chǎn)生可遺傳的基因編輯［102］。實(shí)驗(yàn)證明65%的后代幼苗基因組中都出現(xiàn)了PDS基因等位突變，并且該系統(tǒng)同時(shí)靶向了3個(gè)基因座的效率與靶向一個(gè)基因座的編輯效率相同，都獲得了在編輯位點(diǎn)發(fā)生突變的后代植株?；赥RV載體的VIGS廣泛運(yùn)用在作物和模式植物的基因功能研究中［28］，其引導(dǎo)基因編輯攜帶可移動(dòng)的sgRNA在植物中創(chuàng)建可遺傳的基因編輯有助于揭示基因功能，打開(kāi)通往植物基因功能研究新世界的大門(mén)。

從分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)建立開(kāi)始，最初生物學(xué)家只是開(kāi)發(fā)克隆新的病毒載體，隨著高通量測(cè)序的飛速發(fā)展科研工作者利用VIGS技術(shù)更廣泛的沉默了感興趣的基因，但是沒(méi)人在十年前預(yù)測(cè)出病毒載體可以輔助進(jìn)行基因編輯，而現(xiàn)在VIGS作為輔助基因編輯工具在功能基因組學(xué)和病毒傳遞遺傳中大放光彩。事實(shí)上這些轉(zhuǎn)變證明了人們才剛開(kāi)始摸索發(fā)掘VIGS的無(wú)限可能性，新技術(shù)推動(dòng)了極具創(chuàng)新的新穎應(yīng)用的發(fā)展，甚至VIGS還可以運(yùn)用到非轉(zhuǎn)基因遞送技術(shù)中是運(yùn)送脂質(zhì)體納米材料的理想途徑［103］。VIGS作為重要的功能基因研究手段已經(jīng)迎來(lái)了令人振奮的新時(shí)代。