原核生物中生物素代謝調(diào)控因子研究進(jìn)展

陳昱宏，吳 杭，張部昌

(安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230601)

生物素(也稱維生素H或B7)是一種重要的微量營(yíng)養(yǎng)素，可作為生物素依賴性酶(生物素依賴性羧化酶、脫羧酶和轉(zhuǎn)羧酶)的輔助因子，它通過(guò)共價(jià)鍵與賴氨酸殘基相連，參與脂肪酸合成、氨基酸代謝和糖異生等代謝過(guò)程[1-2]。原核生物通常通過(guò)外界攝取或自身合成兩種途徑獲得生物素，但部分原核生物(生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型)體內(nèi)不具有完整的生物素代謝途徑，因此只能攝取外界生物素[3-4]。原核生物中常見(jiàn)的生物素依賴性酶有丙酮酸羧化酶[5]和丙酰輔酶A羧化酶[6]等。在大腸桿菌(Escherichiacoli)中，存在單一的生物素依賴性酶，即乙酰輔酶A羧化酶，催化脂肪酸生物合成途徑的第一步[7-8]。當(dāng)缺乏生物素時(shí)，細(xì)胞活力降低，甚至導(dǎo)致死亡[9-10]。而生物素充足時(shí)，細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程加快，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物[4]。

在多數(shù)原核生物中，編碼生物素的生物合成酶基因通常聚集成操縱子[11]，這些基因具有較高的保守性,見(jiàn)圖1(a)[2,12]。目前，對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的生物素合成途徑研究比較深入，大體分為庚二酰-CoA的合成和雙環(huán)的組裝兩個(gè)部分[2]。如圖1(b)所示，庚二酰-CoA的合成途徑主要分為兩種，包括以大腸桿菌為代表的BioC-BioH途徑[13-14]和以枯草芽孢桿菌為代表的BioI-BioW途徑[15-16]。有些原核微生物進(jìn)化出BioV[17]、BioZ[18]等，可代替BioH的功能。而雙環(huán)的組裝相對(duì)保守[2]，其過(guò)程近年來(lái)也逐漸被揭示[1-2]。7-酮基-8-氨基壬酸(KAPA)是該過(guò)程的第一個(gè)中間產(chǎn)物，由7-酮基-8-氨基壬酸合酶(BioF)將L-丙氨酸組裝到庚二酰-CoA而成。7,8-二氨基壬酸合成酶(BioA)可使SAM的氨基轉(zhuǎn)移至KAPA，從而生成7,8-二氨基壬酸(DAPA)。脫硫生物素合成酶(BioD)催化脲基環(huán)閉合，形成脫硫生物素(DTB)后，由生物素合成酶(BioB)催化噻吩雜環(huán)的閉合，形成生物素(Biotin)。最近也有報(bào)道BioU代替BioA發(fā)揮功能的情況[19]。生物素的生物合成不僅需要上述4種酶的參與，還需消耗20個(gè)ATP，是一個(gè)高耗能的過(guò)程[20-22]。鑒于生物素從頭合成成本較高，因此需要嚴(yán)格控制生物素生物合成酶的轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)原核生物中存在多種類型的調(diào)控因子，可參與控制生物素的代謝過(guò)程。本文根據(jù)已有報(bào)道對(duì)調(diào)控因子類型、分布及生物學(xué)功能進(jìn)行綜述。

(a)不同微生物中生物素合成基因分布示意圖；(b)微生物中生物素合成的過(guò)程

1 生物素代謝調(diào)控因子的類型

目前研究顯示，原核生物中生物素代謝的調(diào)控因子主要有3種類型：BirA、BioR和BioQ。最早發(fā)現(xiàn)的生物素調(diào)控因子是BirA[11]，它由生物素蛋白連接酶(Biotin Protein Ligase，BPL)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DBD)兩部分組成，因此BirA既是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子又是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)生物素化的酶[3]。迄今已在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[23]和超嗜熱古菌(PyrococcushorikoshiiOT3)[24]等原核生物中解析了BirA蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所有BirA都具有BPL，但只有部分BirA具有DBD[9](圖2)。基于此，研究人員將BirA分為兩種類型。

圖2 原核生物中3種類型的生物素代謝調(diào)控因子

Ⅰ型BirA的N-末端缺失DBD，僅由蛋白質(zhì)生物素化所需的保守催化模塊組成。因此生物素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控必須由其他調(diào)控因子完成。在α-變形菌中，GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioR可替代BirA行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[25]。而在放線菌中，TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioQ可充當(dāng)BirA的DBD[4, 20]。BirA與BioR/BioQ之間似乎可通過(guò)某種信息交流相互影響(圖2)，進(jìn)而影響生物素代謝，但其作用機(jī)理至今尚不清楚。Ⅱ型BirA同時(shí)含有BPL和DBD，具有生物素連接酶和轉(zhuǎn)錄抑制子活性，因此是一種雙功能蛋白。該類BirA存在于γ-變形菌、芽孢桿菌及各種古菌等原核生物中。在Ⅱ型BirA中，大腸桿菌的BirA被廣泛研究，已經(jīng)成為BirA結(jié)構(gòu)、遺傳和生物物理學(xué)研究的主要對(duì)象[26-27]。

2 生物素代謝調(diào)控因子的功能

2.1 BirA的雙功能

BirA催化蛋白質(zhì)生物素化是通過(guò)兩步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[9]，BPL含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)催化核心，負(fù)責(zé)生物素-5′-AMP的合成和蛋白質(zhì)生物素化[28]。在第一部分反應(yīng)中，生物素和ATP形成生物素-5′-AMP(Holo-BirA)。在含有Ⅱ型BirA的原核生物中，Holo-BirA具有兩種不同的命運(yùn)[29-30](圖3)。一方面，Holo-BirA可以二聚化并結(jié)合DNA，起生物素生物合成操縱子的轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而抑制生物素的合成。Satiaputra等[23]在金黃色葡萄球菌中還發(fā)現(xiàn)，BirA(或Holo-BirA)可先以單體的形式結(jié)合到DNA上，再進(jìn)行二聚化。另一方面，Holo-BirA中的BPL可以識(shí)別并靶向結(jié)合生物素羧基載體蛋白(BCCP)上的賴氨酸殘基，使蛋白質(zhì)生物素化。蛋白質(zhì)生物素化是精準(zhǔn)且特異的，如大腸桿菌的BirA僅修飾4 000種蛋白中的一種[31]。不同生物的BPL和BCCP通常可以相互結(jié)合[32]。這表明生物進(jìn)化過(guò)程中BPL的催化機(jī)制以及酶與底物之間的蛋白質(zhì)相互作用都高度保守[33-35]。

圖3 BirA的雙功能

目前有兩種關(guān)于Holo-BirA功能選擇的假說(shuō)(圖4)。Pendini和Weaver等[36-37]認(rèn)為，當(dāng)存在過(guò)量的BCCP時(shí)，Holo-BirA將優(yōu)先結(jié)合BCCP，從而阻止了Holo-BirA二聚化；當(dāng)BCCP濃度低時(shí)，Holo-BirA會(huì)積累并二聚化，導(dǎo)致DNA結(jié)合并隨后抑制轉(zhuǎn)錄，在該模型中，Holo-BirA的功能轉(zhuǎn)換是由Holo-BirA和BCCP的相互競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致。但Solbiati等[38]認(rèn)為這種競(jìng)爭(zhēng)并不是Holo-BirA功能選擇的關(guān)鍵，他們認(rèn)為BCCP與Holo-BirA具有更強(qiáng)的親和力，BCCP可以酶底物的形式解除Holo-BirA的二聚化，使其發(fā)揮生物素蛋白連接酶功能。酶與底物的反應(yīng)是短暫的，當(dāng)BCCP與Holo-BirA分開(kāi)后，Holo-BirA以單體形式存在，而單體Holo-BirA積累后易發(fā)生二聚化，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄阻遏功能。

圖4 BirA的功能選擇

2.2 BioR的調(diào)控功能

對(duì)α-變形菌基因組序列的生物信息學(xué)分析表明，這些原核生物生物素的合成受BioR調(diào)控[25]。同時(shí)，在生物素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白bioY基因的上游發(fā)現(xiàn)了BioR的DNA識(shí)別序列。在布魯氏桿菌(Brucellamelitensis)和脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)中，bioR基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了BioR識(shí)別序列[22, 39]，證明BioR具有BirA所沒(méi)有的自我調(diào)控特征，但根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中bioR基因的上游不存在BioR識(shí)別序列[21]，因此這種調(diào)控并不完全保守(圖5)。

圖5 不同α-變形菌中BioR的識(shí)別位點(diǎn)

Feng等[21-22]進(jìn)一步研究了BioR在生物素合成中的調(diào)控作用，除了結(jié)合自身基因的識(shí)別序列外，根瘤農(nóng)桿菌的BioR還能與其他菌的DNA序列結(jié)合[21]。而布魯氏桿菌的BioR能夠在體內(nèi)抑制根瘤農(nóng)桿菌bioB的表達(dá)[22]。這表明BioR在α-變形菌中具有較高的保守性[9]。根瘤農(nóng)桿菌中，BioR只能結(jié)合bioB啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)生物素合成基因的轉(zhuǎn)錄起到抑制功能[21]。而在布魯氏桿菌中，BioR識(shí)別序列位于編碼bioR和bioY的上游，實(shí)驗(yàn)表明BioR不僅具有自我調(diào)控功能，還可介導(dǎo)生物素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[22]。同時(shí)，bioBFDAZ操縱子的上游也存在兩個(gè)BioR識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)BioR對(duì)其具有轉(zhuǎn)錄抑制功能[22]。這些結(jié)果說(shuō)明BioR介導(dǎo)的生物素代謝具有復(fù)雜調(diào)控方式。

在脫氮副球菌中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)BioR同源物，分別稱為BioR1(Pden_1431)和BioR2(Pden_2922)[39]，并發(fā)現(xiàn)該菌基因組中存在6個(gè)BioR結(jié)合位點(diǎn)，其中兩個(gè)bioR啟動(dòng)子區(qū)各有一個(gè)位點(diǎn)，兩個(gè)生物素代謝操縱子(bioBFDAGC和bioYB)啟動(dòng)子區(qū)各有兩個(gè)串聯(lián)的位點(diǎn)。BioR1和BioR2可以共同調(diào)控生物素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)它們之間也可以相互調(diào)控與自我調(diào)控[39]。外源添加生物素刺激了bioYB的表達(dá)，同時(shí)抑制了bioBFDAGC的轉(zhuǎn)錄，這同樣表明BioR調(diào)控生物素代謝基因的復(fù)雜性[39]。

從BioR中完全去除或添加生物素對(duì)其體外DNA結(jié)合沒(méi)有影響，說(shuō)明生物素并不是BioR的配體[21-22]，而發(fā)現(xiàn)各種生物素代謝中間產(chǎn)物，也不是BioR的配體[22, 39]。因此，BioR配體可能要在生物素代謝的上下游中尋找。

2.3 BioQ的調(diào)控功能

放線菌中生物素代謝的調(diào)控模式類似于α-變形菌，但是由BioQ行使調(diào)控功能。在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中，生物素合成途徑不完整，從而使其生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷。但是，在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)一種TFR(BioQ)，可以調(diào)控生物素代謝[4]。Brune等[4]通過(guò)生物信息學(xué)分析，在谷氨酸棒狀桿菌中定位了bioQ基因和生物素合成基因，發(fā)現(xiàn)bioQ和生物素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BioY)基因啟動(dòng)子中均含有BioQ的識(shí)別序列(圖6)，并實(shí)驗(yàn)證實(shí)BioQ可調(diào)控這兩個(gè)基因的表達(dá)，這表明該轉(zhuǎn)錄因子具有自我調(diào)控功能，同時(shí)對(duì)生物素的轉(zhuǎn)運(yùn)也具有調(diào)控作用，這對(duì)于生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型谷氨酸棒桿菌至關(guān)重要。

在恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)中，BioQ的識(shí)別位點(diǎn)位于bioF和bioQ/B基因的上游(圖6)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)BioQ可抑制生物素代謝基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)具有自我調(diào)控功能[20]。此外，生物素水平的增加導(dǎo)致野生型細(xì)菌生物素生物合成基因bioF、bioD和bioB的表達(dá)降低，說(shuō)明BioQ對(duì)生物素濃度具有感知能力。Yan等[40]對(duì)該BioQ的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，確定了BioQ與DNA探針結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸(R27A和Y41A)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BioQ保守結(jié)合序列(5′-TGAACnnnGTTCA-3′)中任何堿基的改變都會(huì)影響B(tài)ioQ的靶DNA結(jié)合能力。

圖6 不同放線菌中BioQ的識(shí)別位點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，生物素及其代謝途徑中產(chǎn)物均不是BioQ的配體[20]，但丙酸和乙酰磷酸(AcP)似乎可以影響B(tài)ioQ與靶基因的結(jié)合[41-42]，這表明BioQ配體的研究也應(yīng)往生物素代謝的上下游尋找。

3 總結(jié)與展望

目前原核生物中已發(fā)現(xiàn)3種類型的生物素代謝調(diào)控因子(BirA、BioR和BioQ)，可控制不同原核生物中生物素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及利用等代謝過(guò)程，而不同物種的同一種類型調(diào)控因子存在交互調(diào)控作用，這表明生物素的代謝途徑較為保守。目前僅發(fā)現(xiàn)一例多拷貝BioR共同調(diào)控生物素代謝基因，即來(lái)源于脫氮副球菌的雙拷貝BioR[39]，這進(jìn)一步展現(xiàn)了原核生物中生物素代謝的多元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

近年來(lái)，原核生物中生物素代謝調(diào)控因子的研究已逐步深入，但還有很多問(wèn)題亟待解決。在含有I型BirA的生物體中，BioR(或BioQ)可替代BirA發(fā)揮調(diào)控作用，但它們與BirA之間的聯(lián)系還不清楚。BioQ相較其他TetR家族調(diào)控因子，其C端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域較為柔性[40]，暗示其可能存在多種配體，但迄今尚未見(jiàn)到相關(guān)研究報(bào)道。近期發(fā)現(xiàn)，BioQ的乙?；揎椏捎绊懫銬NA結(jié)合能力，證實(shí)蛋白翻譯后修飾對(duì)BioQ發(fā)揮調(diào)控功能至關(guān)重要[41]，但其復(fù)雜的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。相信隨著相關(guān)功能研究的進(jìn)一步深入并對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行解答，將有助于理解原核生物中生物素代謝調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為新型藥物靶點(diǎn)鑒定、合成生物學(xué)元件開(kāi)發(fā)以及代謝產(chǎn)物水平提高等奠定理論基礎(chǔ)。