抗壞血酸對動態(tài)培養(yǎng)體系中mESCs擴增特性的影響

田連華，張 童，蔡海波，譚文松

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237)

ESCs動態(tài)培養(yǎng)過程中，細胞堆積生長形成的聚集體過大，往往會因物質(zhì)傳遞阻力，造成其內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)耗竭和代謝廢物積累，導(dǎo)致聚集體內(nèi)部細胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象[1-3]；此外，動態(tài)培養(yǎng)時，攪拌所產(chǎn)生的剪切力也會導(dǎo)致細胞老化[4]。細胞老化是限制ESCs擴增的主要因素之一。細胞老化有99%是由自由基損傷所致[5-6]。眾多自由基中超氧陰離子和羥自由基等活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)對細胞毒作用最為突出[7-8]。抗壞血酸作為廣泛應(yīng)用的天然抗氧化物之一，可以有效調(diào)節(jié)ROS水平[9-10]。然而，抗壞血酸是否能夠調(diào)節(jié)ESCs的ROS水平，延緩細胞老化進程，促進ESCs的擴增和干性維持，目前尚不明確。因此，以解決細胞老化問題作為切入點，選取mESCs作為研究對象，研究微載體動態(tài)懸浮培養(yǎng)過程中細胞老化的解決策略。

1 材料與方法

1.1 材料

mESCs由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司干細胞資源庫與干細胞研究關(guān)鍵技術(shù)平臺提供。細胞培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(Knockout DMEM，Gibco)，使用時添加15%胎牛血清(Hyclone)、10 ng/mL白血病抑制因子(Perprotech)、1%青霉素-鏈霉素(Beyotime)、1%非必須氨基酸(Sigma)、1%谷氨酰胺(Sigma)以及0.1 mmol/L β-巰基乙醇(Sigma)。實驗組添加抗壞血酸(Sigma)。微載體Cytodex3(GE Healthcare Biosciences AB)，轉(zhuǎn)瓶(Corning)。

1.2 方法

1.2.1 mESCs的動態(tài)擴增培養(yǎng)

稱取0.08 g/瓶(1 mg/mL，80 mL培養(yǎng)體系)的Cytodex3加PBS室溫水合過夜。次日用PBS清洗2次，120 ℃高壓蒸汽滅菌50 min，冷卻后加至40 mL培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。將mESCs以1×105mL-1的密度接至轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為30 r/min，每隔27 min攪拌3 min，持續(xù)8 h以促進細胞貼壁。接種24 h后補加培養(yǎng)液至培養(yǎng)體積為80 mL。研究設(shè)對照組和實驗組，實驗組從第2天起每天向培養(yǎng)體系中添加50 μg/mL抗壞血酸，而對照組不添加。從第3天開始兩組均每天半量換液。培養(yǎng)過程中每2天均勻吸取1 mL聚集體懸液，用0.25%胰酶溶液消化成單細胞懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，換算得出1 mL聚集體懸液中的細胞密度，總細胞擴增倍數(shù)計算公式：

總細胞擴增倍數(shù)=

[1 mL聚集體懸液細胞密度(mL-1)×80 mL]/

[1×105mL-1×80 mL]。

1.2.2 SSEA-1+細胞比例測定

SSEA-1作為mESCs表面特異性抗原，SSEA-1+細胞的比例可反映培養(yǎng)物中mESCs的數(shù)量多少。將取得的細胞樣品一分為二，抗體稀釋液洗2次，一份樣品加入10 μL抗鼠PE-SSEA-1抗體(BD)后混勻，另一份不加抗體作為空白對照。置于4 ℃避光孵育30 min后再用抗體稀釋液洗2次，離心后加入500 μL抗體保存液保存。標(biāo)記好的細胞用流式細胞儀(BD FACSAria I)檢測，用FlowJo軟件分析結(jié)果。SSEA-1+細胞比例和SSEA-1+細胞的擴增倍數(shù)計算公式：

SSEA-1+細胞比例=

[樣本(Q2+Q3)數(shù)值-空白對照(Q2+Q3)數(shù)值]×100%

SSEA-1+細胞的擴增倍數(shù)=

[SSEA-1+細胞比例(%)×總細胞量]/

[接種時SSEA-1+細胞比例(%)×接種時總細胞量]。

1.2.3 堿性磷酸酶染色

細胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)的活性越高，AKP染色的著色越深，說明細胞干性維持越強。因此，根據(jù)AKP染色結(jié)果評判mESCs的細胞質(zhì)量。將細胞樣品用4%多聚甲醛室溫固定15 min，按照堿性磷酸酶染色試劑盒(Beyotime)要求染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 OCT-4蛋白免疫熒光染色

OCT-4蛋白是評價細胞是否為ESCs的指標(biāo)之一。將細胞樣品在4%多聚甲醛溶液中固定15 min，0.1% TritonX-100溶液處理10 min。重組人抗OCT-4單克隆抗體(Millipore，1∶ 200)4 ℃孵育過夜，二抗(Millipore)室溫孵育2 h，PBS洗滌3次。DAPI染色液(1∶ 1 000)室溫復(fù)染10 min，PBS洗滌3次。處理好的細胞用熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ti-S)觀察并拍照。

1.2.5 RT-PCR

采用RT-PCR進行全能性基因Sox2的mRNA表達水平測定。細胞用Trizol裂解液裂解，提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR擴增儀(博華生物科技)擴增cDNA溶液：Ⅰ階段 94 ℃預(yù)變性5 min。Ⅱ階段94 ℃預(yù)變性30 s；58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。Ⅲ階段72 ℃延伸7 min。Ⅳ階段4 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳儀在120 V恒壓條件下進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。RT-PCR過程中所用的引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6 SA-β-Gal活性染色(定性檢測)

細胞內(nèi)老化相關(guān)的β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase, SA-β-gal)的活性是反映細胞老化的一個指標(biāo)。當(dāng)細胞發(fā)生老化，其胞內(nèi)SA-β-gal的活性上調(diào)，可催化β-半乳糖底物生成藍色的沉積產(chǎn)物。將細胞樣品用4%多聚甲醛室溫固定15 min，按照SA-β-Gal活性染色試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC.)使用說明書染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 SA-β-Gal酶活力測定(定量檢測)

采用比色法定量測定細胞裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性，用于評價細胞衰老狀況。按照SA-β-Gal定量檢測試劑盒(GENMED SCIENTIFICS INC.)使用說明書進行活性測定，計算公式：SA-β-Gal酶活力(IU/cells)=(OD×0.072×V×ρ)/(6×5.5×0.6×t×n)，其中，OD為使用分光光度計(Beckman)在570 nm波長處測得的樣品吸光度值，0.072為反應(yīng)體系總體積0.072 mL，V為5×105cells細胞裂解的懸液體積0.05 mL，ρ為使用BCA試劑盒(Beyotime)測定的細胞裂解懸液的蛋白濃度μg/mL，6為測定酶活時取等量蛋白量6 μg，5.5為mmol吸光系數(shù)，0.6為所用分光光度計的光徑距離，t為反應(yīng)時間min，n為取樣細胞數(shù)5×105cells。

1.2.8 細胞內(nèi)ROS水平測定

使用活性氧檢測試劑盒(Beyotime)檢測細胞內(nèi)ROS水平[11]，用熒光酶標(biāo)儀(BioTek)測定吸收波長525 nm處的 OD 值，以此來表征細胞內(nèi)的ROS水平。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 動態(tài)培養(yǎng)過程中抗壞血酸對mESCs老化狀態(tài)和胞內(nèi)ROS水平的影響

鑒于細胞發(fā)生老化時，胞內(nèi)SA-β-Gal活性明顯上升，采用動態(tài)微載體懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)mESCs 10 d，每2天取樣定量檢測SA-β-Gal酶活力[圖1(a)]，并對培養(yǎng)8 d的mESCs 胞內(nèi)SA-β-Gal活性進行定性分析[圖1(b)]。從圖1(a)中可以看出，對照組從第6天起mESCs胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力與0 d相比有顯著上升(P<0.05)，而實驗組培養(yǎng)到第10天時胞內(nèi)的SA-β-Gal酶活力才出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)；同時，在培養(yǎng)6～10 d時實驗組的SA-β-Gal酶活力均低于對照組。此外，從圖1(b)中也可以看出，當(dāng)培養(yǎng)進行到第8天時，實驗組細胞染色呈藍色的細胞明顯少于對照組。可見，添加抗壞血酸延緩了培養(yǎng)過程中細胞發(fā)生老化的時間。

(a)mESCs單位細胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力測定(與0 d比較，*P<0.05，**P<0.01)；(b)mESCs的SA-β-Gal活性染色(100×，8 d)

進一步檢測培養(yǎng)6～10 d期間mESCs胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，實驗組mESCs胞內(nèi)ROS水平均低于對照組，兩組之間8～9 d時呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)?？梢?，添加抗壞血酸后顯著降低了培養(yǎng)過程中mESCs胞內(nèi)ROS水平。

*表示和對照組比較P<0.05

2.2 動態(tài)培養(yǎng)過程中抗壞血酸對mESCs擴增特性的影響

mESCs在動態(tài)培養(yǎng)過程中細胞的擴增情況如圖3所示。從圖3(a)中可以看出，培養(yǎng)第6天時實驗組的總細胞擴增倍數(shù)與對照組有顯著差異(P<0.05)，而在第8天時，兩組的細胞擴增倍數(shù)之間呈現(xiàn)極顯著差異，實驗組細胞最大擴增倍數(shù)為53.9±1.5，極顯著高于對照組的41.3±0.9(P<0.01)。從圖3(b)細胞形態(tài)觀察中也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)第8天時實驗組中空載微載體數(shù)量少，且微載體上細胞量要多于對照組，而到第10天時，兩組均出現(xiàn)了聚集體渙散的情況。可見，添加抗壞血酸促進了mESCs在動態(tài)培養(yǎng)條件下的擴增。

(a)mESCs的擴增倍數(shù)(與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01);(b)mESCs形態(tài)鏡檢視野(100×)

培養(yǎng)過程中，進一步采用流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)物中SSEA-1+細胞比例的變化[圖4(a)、(b)]，并計算其擴增倍數(shù)[圖4(c)]。從圖4(b)中可以看出，實驗組和對照組之間的SSEA-1+細胞比例沒有顯著差異；從圖4(c)中可以看出，培養(yǎng)到第8 天時實驗組的SSEA-1+細胞擴增倍數(shù)可達到51.9±6.3，極顯著高于對照組的40.1±3.9(P<0.01)。說明添加抗壞血酸有利于促進SSEA-1+細胞的擴增。

(a)SSEA-1+細胞比例流式分析圖；(b)SSEA-1+細胞比例；(c)SSEA-1+細胞擴增倍數(shù)(和對照組比較，*P<0.05，**P<0.01)

為了評價擴增后mESCs的全能性，對培養(yǎng)后的細胞進行AKP活性、OCT-4蛋白免疫熒光染色及Sox2轉(zhuǎn)錄因子表達的全能性指標(biāo)檢測。從結(jié)果(圖5)可以看出，實驗組及對照組所培養(yǎng)細胞的AKP染色均呈現(xiàn)深紫紅色[圖5(a)]，為AKP高活性；且OCT-4均呈陽性表達[圖5(b)]，說明所培養(yǎng)的細胞仍具有mESCs的標(biāo)志。進一步檢測培養(yǎng)所獲得細胞中mESCs特異性表達的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達水平，從圖5(c)的RT-PCR凝膠電泳圖可以看出兩組培養(yǎng)獲得的細胞中Sox2均呈陽性表達，兩組細胞Sox2的條帶面積均和看家基因GAPDH的相比形成半定量分析圖[圖5(e)]，實驗組Sox2相對表達量和對照組的相比[圖5(d)]落在0.5～2.0倍線之間，無顯著差異?？梢?，兩種條件下培養(yǎng)所獲得的細胞均保有mESCs全能性標(biāo)記。

3 討論

當(dāng)細胞發(fā)生老化時，溶酶體膨脹、增多，位于溶酶體中的β-半乳糖苷酶隨之增多[12]，因此測定SA-β-Gal活性來表征mESCs老化情況[圖1(a)、(b)]。在動態(tài)培養(yǎng)體系中添加抗酸血酸后，培養(yǎng)過程中胞內(nèi)SA-β-Gal酶活力顯著升高的時間從培養(yǎng)6 d延遲到了10 d[圖1(a)]，表明抗壞血酸延緩了細胞出現(xiàn)老化的時間。通過對培養(yǎng)過程中胞內(nèi)ROS水平的測定發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)6～10 d實驗組胞內(nèi)ROS水平均低于對照組，兩組之間在培養(yǎng)8～9 d時呈顯著性差異(圖2)，表明添加抗壞血酸后，顯著降低了胞內(nèi)ROS水平。這與目前文獻[13-16]所報道的抗壞血酸具有調(diào)節(jié)ROS水平的作用一致。鑒于細胞老化發(fā)生原因之一普遍被認(rèn)為是自由基損傷所導(dǎo)致[5-6]，因此，結(jié)果提示培養(yǎng)過程中細胞老化狀態(tài)與細胞內(nèi)ROS水平之間存在對應(yīng)聯(lián)系。

從圖3(b)的動態(tài)培養(yǎng)的mESCs的擴增效果看，添加抗壞血酸后培養(yǎng)體系中空載微載體的數(shù)量減少；由圖3(a)可知，培養(yǎng)到8 d時實驗組mESCs的擴增倍數(shù)可達53.9±1.5，顯著高于對照組的41.3±0.9。同時，實驗組和對照組之間mESCs表面特異性抗原SSEA-1+細胞的比例沒有顯著差別[圖4(b)]，培養(yǎng)8 d時實驗組的SSEA-1+細胞擴增倍數(shù)可達51.9±6.3，顯著高于對照組的40.1±3.9[圖4(c)]。從mESCs的干性指標(biāo)分析結(jié)果可以看出，兩種條件下培養(yǎng)所獲得細胞均保有mESCs全能性標(biāo)記[圖5(a)至(e)]。可見，添加抗壞血酸有利于mESCs的體外擴增。

(a)mESCs內(nèi)AKP染色鏡檢視野(100×，8 d)；(b)mESCs內(nèi)OCT-4蛋白的免疫熒光染色鏡檢視野(100×，8 d)；(c)mESCs中Sox2基因的RT-PCR凝膠電泳視野；(d)mESCs中Sox2基因的相對表達量(和對照組相比)；(e)mESCs中Sox2基因的半定量分析(與GAPDH相比)

在動態(tài)培養(yǎng)體系中，通過在培養(yǎng)過程中不斷向培養(yǎng)液添加抗壞血酸，可顯著降低胞內(nèi)ROS水平，明顯改善mESCs老化狀態(tài)，進而促進mESCs的體外擴增。研究結(jié)果為解決胚胎干細胞規(guī)?；囵B(yǎng)過程中細胞老化問題提供了一種解決思路。