人參皂苷Rg1對慢性應激小鼠抑郁樣行為、海馬突觸蛋白及膠質細胞的作用

王 娟，申豐銘，張崢嶸，朱國旗

(安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室，合肥230038)

抑郁癥已經成為全球疾病負擔的重要原因之一[1]，目前尚無有效治療手段。海馬是一個重要的腦區(qū)，在情緒調節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時也是抑郁研究較為廣泛的腦區(qū)[2]。在抑郁癥的病因學研究中，突觸的作用已引起越來越多的關注。在抑郁動物模型中，突觸可塑性的調節(jié)出現(xiàn)異常[3-4]，以突觸后致密蛋白-95(Postsynaptic density protein 95, PSD-95)、活性調節(jié)細胞骨架相關蛋白(Activity-regulated cytoskeleton-associated protein, Arc)和腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等的表達下降為典型[5-6]。炎癥是抑郁發(fā)病的另一個重要機理，已發(fā)現(xiàn)抑郁患者血清中炎癥生物標志物水平增加[7-8]，而星型膠質細胞和小膠質細胞活化是炎癥發(fā)生重要的源頭[5]。人參皂苷Rg1是中藥人參的主要活性成分，具有調控可塑性、抗氧化、改善學習記憶等生物學活性[9]。研究表明人參皂苷Rg1具有改善小鼠抑郁樣行為[10]。但是人參皂苷Rg1對抑郁干預的機理，特別是對海馬突觸可塑性和炎癥反應的調節(jié)仍然未知。本研究通過慢性溫和不可預見應激模型(Chronic unpredictable mild stress, CUMS)研究人參皂苷Rg1對抑郁樣行為的干預作用，并利用免疫印跡以及免疫熒光等方法，從炎癥反應和突觸可塑性兩個方面探討人參皂苷Rg1干預CUMS小鼠抑郁樣行為的機理。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物

30只雄性C57BL/6小鼠(2月齡，體重：20～25 g)，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心(SCXK(皖)2016-0009)。將小鼠飼養(yǎng)在溫度為22 ℃±2 ℃，相對濕度為45%～65%的環(huán)境中，經歷12 h的明/暗循環(huán)，可隨意飲水和攝食。實驗方案由安徽中醫(yī)藥大學倫理委員會監(jiān)督。人參皂苷Rg1(HPLC ≥ 98%，源葉生物科技，上海，中國)。

1.2 動物分組、造模與給藥

30只雄性C57小鼠喂養(yǎng)一周適應環(huán)境，然后將小鼠隨機分為5組，每組6只小鼠(n=6)，分別是正常組、CUMS模型組、CUMS+人參皂苷Rg1高、中、低劑量給藥組(給藥劑量分別是40、20 和10 mg/kg)。

在CUMS造模期間，一共使用8種刺激：夾尾5 min，飲食剝奪24 h，飲水剝奪24 h，晝夜顛倒24 h，束縛2 h，電擊(3次，強度為1 mA，持續(xù)2 s)，潮濕環(huán)境2 h，熱刺激(45 ℃～50 ℃，5 min)，每天隨機抽取兩種刺激，使小鼠無法預測刺激，共計28 d；人參皂苷Rg1組在第21天后開始進行腹腔注射給藥(40、20 和10 mg/kg，每天1次)，正常組和CUMS模型組腹腔注射等量的生理鹽水。給藥一周后進行行為學測試，收集海馬組織(圖1)。

圖1 實驗流程

1.3 實驗觀測指標

1.3.1 糖水偏好

每次測試時，將2個瓶子的位置進行顛倒。在小鼠適應期間，訓練其品嘗蔗糖水。待適應完成后，禁水24 h后進行蔗糖偏好測試。通過量筒記錄糖水的消耗，每周測試一次。蔗糖偏好指數(shù)=蔗糖消耗量/飲水總量×100%。

1.3.2 體重變化

從第1周開始，稱量小鼠體重，每隔1周測1次，共計5次，并記錄數(shù)據進行分析。

1.3.3 懸尾實驗(Tail suspension test，TST)

將小鼠放在測試房間中1 h適應環(huán)境。在安靜的環(huán)境中進行TST，在小鼠尾端2 cm處固定，使小鼠保持倒掛狀態(tài)，頭部距臺面約50 cm,兩側用板隔開動物視線。允許其運動6 min，并通過Supermaze軟件(上海欣軟信息科技)記錄其行為。前2 min是適應期，記錄后4 min小鼠的不動時間。

1.3.4 曠場實驗(Open field test，OFT)

將小鼠置于立方體室的中心[400 mm(W)×400 mm(H)×400 mm(D)]，并使其自由移動5 min。使用自動分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技)比較各組之間的站立次數(shù)，中心路程與總路程的比值。

1.3.5 強迫游泳(Forced swimming test，F(xiàn)ST)

將小鼠分別置于水溫為22 ℃±3 ℃的2 000 mL玻璃容器中，允許動物運動6 min，并通過Supermaze軟件(上海欣軟信息科技)記錄其行為。前2 min是適應期，記錄后4 min小鼠的不動時間。

1.3.6 蛋白免疫印跡(Western Blot, WB)

從各組獲得來自動物的海馬組織，勻漿并裂解，使用BCA試劑盒(Beyotime Institute of Biotechnology)檢測蛋白質濃度。蛋白樣品通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%體積分數(shù)凝膠)在110 V下分離60 min，并在200 mA下轉移到硝酸纖維素膜上2 h。在室溫下，將膜用5%質量分數(shù)脫脂牛奶(溶于含0.1%體積分數(shù)Tween-20的PBS中)封閉2 h，然后在4 ℃下與相應抗體孵育過夜：PSD95(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)；Arc(1∶ 1 000; Synaptic Systems, Goettingen, Germany)；GFAP(1∶ 1 000; Beyotime, Beijing, China)；Iba1(1∶ 1 000; Beyotime, Beijing, China)；BDNF(1∶ 1 000; Novus, Colorado, USA)；NF-κB(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)；β-actin(1∶ 1 000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)，隨后在室溫下與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG(1∶ 10 000; Zs-Bio, Beijing, China)孵育2 h。使用ImageJ軟件對圖像進行分析，計算條帶的光密度值。

1.3.7 免疫熒光(Immunofluorescent staining)

全腦于4 ℃在質量分數(shù)4%的多聚甲醛中固定24 h后，在質量分數(shù)30%的蔗糖水中脫水24 h，并在冷凍切片機上切片，厚度為20 μm。將切片在含有體積分數(shù)10%山羊血清和體積分數(shù)0.4%Triton X-100的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中封閉1 h。然后在4 ℃下與相應的一抗孵育過夜：GFAP(1∶ 100, Beyotime, Beijing, China)。將切片在PBS中洗滌3次(每次15 min)。并與熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?488)(1∶ 200, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)室溫下孵育2 h，DAPI復染細胞核，封片。用FV1000 Olympus激光共焦掃描顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)拍攝圖像(放大倍數(shù)：×200)。

1.3.8 統(tǒng)計分析

應用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據用平均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析使用方差分析(ANOVA)進行，并使用Bonferroni分析組間差異，以P值小于0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 人參皂苷Rg1減輕CUMS誘導的抑郁樣行為

第一周各組小鼠體重沒有顯著差異[圖2(a)，P>0.05)]。而在CUMS造模后的一周，除正常組外的小鼠體重均有下降趨勢[圖2(a)]，而給予人參皂苷Rg1后，小鼠的體重較模型組有明顯的上升趨勢，其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組小鼠體重上升較顯著[圖2(a)，P<0.05]。與正常組相比，CUMS應激后的小鼠對糖水的喜好程度明顯偏低(P<0.05)；而與CUMS模型組比較，人參皂苷Rg1給藥組對糖水的喜好程度有上升趨勢，其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組小鼠上升較為顯著[圖2(b)，P<0.05]。

模型組小鼠較正常組小鼠在懸尾實驗[圖2(c)]和強迫游泳實驗[圖2(d)]中的不動時間均顯著增加(vs 正常組，P<0.05)。人參皂苷Rg1組小鼠不動時間均顯著減少(vs 模型組P<0.05)。曠場實驗中，各組小鼠之間的站立次數(shù)[圖2(e)，P>0.05]及在中心路程與總路程之比無顯著性差異[圖2(f)，P>0.05]。

(a)小鼠體重變化；(b)糖水偏好指數(shù)；(c)懸尾實驗后4 min的不動時間；(d)強迫游泳實驗后4 min的不動時間；(e)曠場實驗中小鼠站立次數(shù)；(f)曠場實驗中小鼠中心路程/總路程。每組6只(n=6), #：P<0.05 vs 正常組; *：P<0.05 vs 模型組

in CUMS mice

2.2 人參皂苷Rg1抑制CUMS誘導的海馬突觸相關蛋白表達下降

與正常組相比，CUMS小鼠海馬PSD95、Arc和BDNF表達均下降(P<0.05)。人參皂苷Rg1能抑制CUMS小鼠PSD95[圖3(a)]、Arc[圖3(b)]和BDNF表達的下降[圖3(c)],其中以20 mg/kg組和40 mg/kg組作用較為顯著(vs 模型組，P<0.05)。

(a)PSD95表達水平；(b)Arc表達水平；(c)BDNF表達水平。每組n=5～6;#:P<0.05 vs 正常組; *:P<0.05 vs 模型組

2.3 人參皂苷Rg1下調CUMS誘導的海馬膠質細胞標記物和NF-κB的表達

CUMS模型小鼠的海馬星形膠質細胞的標志物GFAP表達上升(vs 正常組,P<0.05)，而人參皂苷Rg1能抑制CUMS誘導的GFAP表達的上升[圖4(a)，vs CUMS,P<0.05]。與正常組比較，CUMS模型組小鼠海馬小膠質細胞標記物Iba1的表達也升高，而人參皂苷Rg1能抑制CUMS誘導的Iba1表達上升[圖4(b)，vs CUMS,P<0.05)]。NF-κB相關通路與炎癥密切相關，和正常組比較，CUMS模型組NF-κB表達顯著增高，而人參皂苷Rg1顯著抑制CUMS誘導的NF-κB表達[圖4(c)，vs CUMS,P<0.05)]。免疫熒光結果也顯示，CUMS組小鼠海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)量增加，而給予人參皂苷Rg1(40 mg/kg)可以抑制CUMS誘導的海馬DG區(qū)星形膠質細胞的活化[圖4(d)，P<0.05]。

(a)GFAP表達水平；(b)Iba1表達水平；(c)NF-κB表達水平；(d)GFAP免疫熒光代表性圖。每組n=5～6;#:P<0.05 vs 正常組; *:P<0.05 vs 模型組

3 討論與總結

抑郁癥是常見精神疾病之一，目前臨床上常用的抗抑郁藥仍以西藥為主，如：三環(huán)類抗抑郁藥，單胺氧化酶抑制劑等。盡管隨機臨床試驗已經確定了抗抑郁藥的療效[11]，但當前可用的抗抑郁藥需要數(shù)周至數(shù)月才能產生治療效果，有超過30%的患者對這些藥物沒有反應[12]，并且大多數(shù)藥物具有不良反應。中藥以高安全性和耐受性為抑郁癥治療提供有希望的替代方法。人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，具有抗炎、神經保護等多種生物活性[13]。已有證據表明人參皂苷Rg1在抑郁的發(fā)生中起一定的保護作用[14]，但有關人參皂苷Rg1對于抑郁調節(jié)機制，特別是對海馬區(qū)神經突觸可塑性和炎癥反應的調控仍然未知。

研究采用CUMS誘導的小鼠抑郁模型，評價人參皂苷Rg1的抗抑郁作用?？旄腥笔且钟舻囊粋€重要表現(xiàn)，而糖水偏好實驗是評價動物快感缺失程度的良好指標[15]。研究發(fā)現(xiàn)CUMS刺激后的小鼠對糖水的攝取量明顯降低，而人參皂苷Rg1可顯著增加抑郁小鼠的糖水攝取量。強迫游泳和懸尾實驗是用來評價抗抑郁藥療效的另一重要指標，靜止不動時間代表動物抑郁的程度[16]。CUMS小鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的不動時間均顯著上升，人參皂苷Rg1給藥明顯縮短小鼠的不動時間。這些結果表明人參皂苷Rg1能保護CUMS誘導的抑郁樣行為。研究還通過曠場實驗觀察各組小鼠自主活動的變化，各組小鼠的自主活動無顯著性差異，表明人參皂苷Rg1治療后對小鼠的行為學改變確實是由于其抗抑郁作用而不是受小鼠自主活動的影響。

突觸可塑性是大腦動態(tài)適應外部刺激并調節(jié)突觸強度最終形成網絡功能的基本能力[17]。有研究表明突觸可塑性的異常在抑郁的發(fā)病機理中起重要作用[18]。Arc是神經元表達活性調節(jié)的早期基因產物，在調節(jié)樹突棘密度和重塑中起重要作用[19]。PSD95是突觸后膜上重要且豐富的腳手架蛋白，對于突觸可塑性調節(jié)起著重要的作用[20]。BDNF是中樞神經系統(tǒng)中非常重要的生長因子，對中樞神經系統(tǒng)中神經元生長、功能性神經元連接、突觸形成和突觸可塑性至關重要[21]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性應激會導致這些重要的突觸可塑性相關調節(jié)蛋白水平的下降，而給予人參皂苷Rg1顯著改善這些突觸相關蛋白的表達。系列結果均提示人參皂苷Rg1可能通過抑制CUMS誘導的突觸相關蛋白的下降來發(fā)揮保護抑郁樣行為的作用。

炎癥在抑郁的發(fā)病機理中起著重要作用[22]。而小膠質細胞和星形膠質細胞作為大腦中主要的先天免疫細胞，它們會被感染、壓力等引起中樞神經系統(tǒng)的損傷而導致神經炎癥所激活[23-24]?；罨男∧z質細胞會引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，釋放促炎性細胞因子、趨化因子、炎性介質等，并誘導星形膠質細胞的相互激活[25]。小膠質細胞和星形膠質細胞活化升高與抑郁的發(fā)病機制有關[24,25-27]。而抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的激活可以改善動物抑郁樣行為[29-30]。研究結果指出在CUMS誘發(fā)的抑郁模型中，海馬中小膠質細胞與星形膠質細胞活化的升高有關。而人參皂苷Rg1可以抑制海馬星形膠質細胞和小膠質細胞的活化。此外，研究結果還表明CUMS小鼠海馬NF-κB的表達升高，而人參皂苷Rg1可抑制海馬NF-κB的表達。NF-κB作為一種快速誘導轉錄因子，是機體免疫、炎癥等過程的關鍵調節(jié)因子[31]。抑制NF-κB及其信號轉導途徑可以改善神經炎癥[5]，而炎癥與抑郁密切相關。因此，人參皂苷Rg1的抗抑郁作用可能與抑制小鼠海馬NF-κB表達從而減輕炎癥反應有關，但本實驗沒有對炎癥因子進行進一步的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可以減輕CUMS誘發(fā)的小鼠抑郁樣行為，其抗抑郁作用可能是通過促進海馬突觸相關蛋白表達以及抑制炎癥反應相關。