微塑料對城市污水中胞內(nèi)和胞外抗性基因的富集特征研究

吳文斌, 付樹森, 毛步云, 程 遠, 黃雅夢, 袁青彬

南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 江蘇 南京 211816

當(dāng)前全球塑料產(chǎn)量每年已超過3×108t，其中90%以上最終排放到環(huán)境中. 經(jīng)過長期理化作用分解成較小片段，最終以小于5 mm的尺寸為主，即為微塑料[1]. 微塑料在環(huán)境已被廣泛檢出，包括海洋、河流和飲用水源，甚至包括深海沉積物等極端環(huán)境，已成為一個全球性環(huán)境問題[2-3]. 其中城市污水廠由于接收大量含微塑料的生活污水和工業(yè)廢水等，成為微塑料的重要儲存庫[4-5]. 在進水和活性污泥中微塑料的濃度為10～100個/L，是海洋和河流等的數(shù)百倍[6]，代表性的微塑料類型有聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)和聚苯乙烯(PS)等[7-8]. 污水處理工藝不能完全去除微塑料，在出水中其濃度為0.20～1.73個/L，而剩余污泥中濃度更是在100個/g以上[9].

由于污水廠也是另一種新型污染物——抗性基因ARGs的重要污染源[15-18]，微塑料可能與抗性基因充分接觸和作用，然而目前關(guān)于微塑料攜帶抗性基因的污染研究還不充分. 少數(shù)研究者已經(jīng)報道了微塑料對抗性基因的富集特征，發(fā)現(xiàn)微塑料同樣能顯著富集水環(huán)境中的抗性基因[19-20]. 然而對微塑料富集抗性基因的具體過程和影響因素研究仍不夠完善. 此外，尚鮮見研究者考察胞外抗性基因在微塑料表面的富集特征. 胞外抗性基因也是抗性基因的重要存在形式，在許多環(huán)境中其豐度常高于胞內(nèi)抗性基因[21].

鑒于此，該研究選取聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、再生聚乙烯(RCPE)4種常見的微塑料種類為研究對象，考察微塑料對城市污水中胞內(nèi)iARG和胞外抗性基因eARG的富集特征；以tetA作為代表性抗性基因(其在污水中檢出廣泛且豐度較高[22-24])考察微塑料粒徑、濃度及污水類型對胞內(nèi)和胞外抗性基因富集特征的影響，旨在綜合評估微塑料攜帶污水中抗性基因的復(fù)合污染特征，為評價其后續(xù)健康風(fēng)險提供理論和試驗支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯和再生聚乙烯塑料均購自東莞市大京九塑膠原料市場，其密度分別為0.62、1.04、0.92、0.91 g/cm3. 所有塑料經(jīng)過研磨機研磨處理，經(jīng)不同目徑篩子得到約1.5、0.4、0.2、0.1 mm的4種微塑料，即再生聚乙烯(RCPE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE). 污水水樣為進水、活性污泥、二沉池出水，取自南京某城市污水處理廠，進水水樣收集后過35目(約0.43 mm)大孔徑篩網(wǎng)2次以去除大顆粒雜質(zhì)，所有水樣使用前搖勻.

1.2 富集試驗

所有試驗材料在試驗前均進行滅菌處理. 稱取40 mg微塑料加入含200 mL不同污水樣品的燒杯，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為300 r/min反應(yīng)6 h，富集后的微塑料通過10 μm濾紙過濾與溶液分離后用于提取DNA. 為考察微塑料粒徑的影響，以再生聚乙烯為代表，分別稱取40 mg四種粒徑(1.5、0.4、0.2、0.1 mm)的微塑料加入到200 mL二沉池出水中進行上述富集反應(yīng). 為考察微塑料濃度的影響，以0.2 mm的再生聚乙烯代表，分別稱取10、20、40、100 mg的微塑料加入到200 mL二沉池出水中進行上述富集反應(yīng). 為考察微塑料富集抗性基因的動力學(xué)特征，稱取40 mg的0.2 mm再生聚乙烯加入到一系列200 mL二沉池出水中，分別進行富集反應(yīng)2、4、6、12 h. 為考察其他污染物對微塑料富集抗性基因的影響，稱取40 mg 0.2 mm的再生聚乙烯加入到一系列200 mL二沉池出水后，再分別加入不同濃度的四環(huán)素(0、20和200 μg/L)或富里酸(0、5和50 mg/L)進行上述富集反應(yīng). 所有試驗均在常溫〔(25±2)℃〕下進行，均設(shè)3組平行.

1.3 胞內(nèi)及胞外DNA的提取

將富集抗性基因的微塑料轉(zhuǎn)移至15 mL磷酸鹽緩沖液中以150 r/min振蕩10 min，此時胞外抗性基因與部分胞內(nèi)抗性基因會振蕩到溶液中. 將微塑料與溶液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾，濾液用于提取胞外DNA，而濾膜及微塑料用于提取胞內(nèi)DNA[25].

胞外DNA的提取采用磁珠法，該方法由筆者所在課題組構(gòu)建，具有提取效率高、操作步驟簡易、提取不受樣品條件的限制、回收率較高等優(yōu)點[25]. 磁珠購于無錫百格生物科技有限公司，取之前保存的溶液樣品2 mL加入15 mL離心管，隨后加入4 mL Buffer CL(20 g/L的蛋白酶K)以及3 mL異丙醇手搖混合，漩渦振蕩2 min以充分混勻. 加入30 μL懸浮的磁珠，漩渦振蕩4 min使磁珠與DNA充分混合. 將離心管放置于磁力架靜置70 s后棄掉上清液. 加入600 μL Buffer CW1(7 mol/L的鹽酸胍與等體積異丙醇互溶)，用移液槍打勻后振蕩1 min，繼續(xù)放置到磁力架上70 s，隨后棄去液體. 用Buffer CW2(75%的乙醇溶液)進行同樣的操作，清洗磁珠2次. 隨后將離心管放置于室溫下靜置10 min后，加入30 μL提前55 ℃預(yù)熱的Elution Buffer，振蕩30 s使其充分混合，隨后每隔1 min振蕩30 s，持續(xù)5 min. 將溶液與磁珠分離后即得到胞外DNA. 胞內(nèi)DNA的提取采用土壤DNA提取試劑盒(FastDNATMSPIN kit for soil，MPbio，美國)，將濾膜與微塑料加入提取管中，按照操作說明書提取. 所有提取的DNA均用Nanodrop測定濃度，4 ℃ 下保存，備用.

1.4 抗性基因的定量檢測

采用熒光定量PCR(qPCR)檢測ARG濃度，將tetA標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋10倍，并選取6個梯度作為定量qPCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線. qPCR的加樣在8連管中進行. 每個樣品20 μL，包含10 μL的2×SuperReal PreMix Plus 〔(Tiangen Biotech，天根生化科技(北京)有限公司〕，2 μL的50×Rox染料〔Tiangen Biotech，天根生化科技(北京)有限公司〕，0.4 μL的上下引物、6.2 μL ddH2O以及1 μL DNA模板.tetA的上下引物序列分別為GCTACATCCTGCTTGCCTTC與CATAGATCGCCGTGAAGAGG[26].

qPCR的反應(yīng)在qPCR儀(ABI7500，美國)上進行. 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱15 min(40個擴增循環(huán)),95 ℃保持10 s(模板變性)，退火20 s，64 ℃保持30 s(熔化過程). 樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時反應(yīng)且操作步驟一致，最后根據(jù)樣品的循環(huán)數(shù)Ct值計算樣品的基因拷貝數(shù). 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)應(yīng)大于0.99. 樣品設(shè)置3組平行，確保平行樣品之間數(shù)值偏差小于5%，所有樣品的擴增效率在90%～110%之間[25].

1.5 數(shù)據(jù)分析

微塑料上富集ARGs的濃度用式(1)計算，微塑料對抗性基因的富集倍數(shù)用式(2)計算.

(1)

(2)

式中：ca為微塑料上富集的ARGs濃度，copies/g；cb為ARGs的富集倍數(shù)，即為微塑料上的ARGs濃度與背景溶液ARGs濃度的比值；c0為原污水中ARGs的背景濃度，copies/mL；c為qPCR反應(yīng)后計算得到的基因濃度，copies/mL；m為微塑料的質(zhì)量，g；v為溶解DNA的溶劑體積，mL，其中溶解iDNA、eDNA分別需要0.05、0.03 mL；ρ為微塑料密度，g/cm3.

分別用準(zhǔn)一級動力學(xué)模型與準(zhǔn)二級動力學(xué)模型〔分別見式(3)(4)〕[27]對污水中微塑料富集ARG的試驗數(shù)據(jù)進行擬合.

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(3)

(4)

式中：t為反應(yīng)時間，h；qe為平衡富集量，copies/g；qt為t時刻的富集量，copies/g；k1為準(zhǔn)一級動力學(xué)模型富集速率常數(shù)，h-1；k2為準(zhǔn)二級動力學(xué)模型富集速率常數(shù)，g/(mg·h).

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0進行，利用t-分布來檢驗數(shù)據(jù)之間的顯著性差異，檢驗過程在顯著性水平為0.05下進行.

2 結(jié)果與討論

2.1 微塑料對胞外抗性基因的富集能力高于胞內(nèi)抗性基因

微塑料(以聚乙烯為例)對胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的富集效果如表1所示. 從富集量來看，胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因都能被大量富集到微塑料上. 微塑料對胞內(nèi)抗性基因的富集濃度在1.15×1011～3.90×1013copies/g之間，對胞外抗性基因的富集濃度在1.34×1012～5.46×1012copies/g之間，二者處于相近的數(shù)量級.

表1 不同污水中胞內(nèi)外抗性基因?qū)ξ⑺芰系母患稊?shù)

然而從富集倍數(shù)來看，微塑料對胞外抗性基因的富集程度更強，如對胞內(nèi)抗性基因的富集倍數(shù)在4.44×101～2.14×103之間，對胞外抗性基因的富集倍數(shù)在3.12×102～4.07×103之間. 可以發(fā)現(xiàn)，同一介質(zhì)中微塑料對胞外抗性基因的富集倍數(shù)最高能達到胞內(nèi)抗性基因的13.1倍. 這可能是由于微塑料與兩種DNA的結(jié)合作用力不同導(dǎo)致. 由于胞內(nèi)抗性基因存在于細菌中，因此微塑料對胞內(nèi)抗性基因的富集實際上是對細菌的富集. 據(jù)報道，細菌可能通過多種方式與微塑料結(jié)合，如通過鞭毛上黏性的多糖、黏附素粘附[27-29]. 此外，細胞壁中的磷酸基團、羥基與微塑料形成氫鍵，對粘附起著重要作用[30]. 而胞外抗性基因為DNA，其電負(fù)性更強，依靠靜電作用與微塑料的結(jié)合作用力相比細菌要更大[31]，因此富集更容易. 此外，胞外抗性基因粒徑遠小于細菌，相同微塑料含量下可以結(jié)合得更多，可能也是其富集倍數(shù)較高的另一原因.

相比于胞內(nèi)抗性基因，微塑料對胞外抗性基因的富集研究尚鮮見報道，該試驗結(jié)果表明，微塑料對胞外抗性基因的富集程度更高，表明微塑料上胞外抗性基因可能具有更嚴(yán)峻的健康風(fēng)險，其通過轉(zhuǎn)化重新進入細胞表達抗藥性[32]，需要引起足夠重視.

2.2 污水類型對微塑料富集抗性基因的影響

污水類型對微塑料富集抗性基因具有顯著影響. 微塑料對二沉池出水中胞內(nèi)抗性基因的富集倍數(shù)最高，達到2.14×103倍，相比之下，對進水和活性污泥的富集倍數(shù)較低. 有學(xué)者[33]同樣發(fā)現(xiàn)污水中微塑料上抗性基因濃度大于活性污泥中. 這可能是因為活性污泥中共存污染物和顆粒物較多，與細菌的富集形成競爭，從而減弱了其對抗性細菌的富集作用，細菌與微塑料之間的氫鍵作用可能與多種污染物的作用力類型一致，故形成競爭富集. 相比之下，微塑料對胞外抗性基因的富集受污染物干擾較小，富集倍數(shù)維持在3.12×102～4.07×103倍. 正如前述，DNA相比細菌不僅體積小，表面帶負(fù)電更強，與微塑料的作用力更強[31]，故較難受到干擾.

為驗證上述推測，筆者分析了外源污染物對微塑料富集抗性基因效果的影響(見圖1)，發(fā)現(xiàn)加入的富里酸濃度從0 mg/L增至50 mg/L時，微塑料對胞內(nèi)抗性基因的富集濃度從5.11×1011copies/g顯著降至1.54×107copies/g，而對胞外抗性基因的富集量變化很小，甚至有所上升. 相似地，當(dāng)加入四環(huán)素濃度從0 μg/L增至200 μg/L時，微塑料對胞內(nèi)抗性基因的富集濃度從5.11×1011copies/g降至2.65×1010copies/g，而對胞外抗性基因的富集量變化同樣不顯著(P>0.05).

圖1 不同濃度四環(huán)素與富里酸對再生聚乙烯富集抗性基因的影響Fig.1 Effects of tetracycline and humic acid on the enrichment of ARGs by RCPE-MPs

污水類型對微塑料富集抗性基因的影響分析表明，隨著污水處理流程的推進，雖然污水中干擾污染物的濃度降低，但微塑料對抗性基因的富集倍數(shù)反而增大. 微塑料富集的污水廠出水中大量抗性基因?qū)㈦S之排放到后續(xù)環(huán)境中，隨著微塑料的不斷遷移，成為抗性污染風(fēng)險的“移動飛鏢”.

2.3 微塑料類型對富集抗性基因的影響

圖2 微塑料類型對富集抗性基因的影響Fig.2 Effect of MPs type on the enrichment of ARGs

3種微塑料對抗性基因的富集能力表現(xiàn)為聚丙烯>聚乙烯≈聚苯乙烯. 聚丙烯富集的抗性基因濃度最大，胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因濃度分別達3.03×1014和6.27×1013copies/g，主要原因可能是聚丙烯為發(fā)泡型塑料，與其他2種微塑料相比其密度小、比表面積大，更容易與抗性基因接觸和富集，WU等[34]同樣發(fā)現(xiàn)聚丙烯具有較強的富集能力. 聚苯乙烯富集的胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因濃度分別為2.69×1012與1.23×1012copies/g. 值得注意的是，聚苯乙烯對胞內(nèi)抗性基因的富集量小于聚乙烯，而對胞外抗性基因的富集量卻略大于聚乙烯. 這可能是由于聚苯乙烯具有弱極性，而聚乙烯為非極性[35]，因此極性的DNA(胞外抗性基因)更容易富集在聚苯乙烯表面. 相比之下，由于與水分子的氫鍵作用，疏水性更強的聚乙烯表面對胞內(nèi)抗性基因(細菌)更具吸引力[31]. 表面的粗糙程度差異也是影響細菌富集的原因，如薛向東等[36]研究了聚乙烯與聚苯乙烯對Cu2+的吸附特征，結(jié)果顯示聚乙烯由于表面更粗糙，其富集能力略大于聚苯乙烯.

再生聚乙烯對ARGs的富集能力與聚乙烯相近，為6.37×1012～9.14×1012copies/g. 由于再生過程和塑料老化有相似之處，該結(jié)果表明微塑料再生或老化后對其富集抗性基因的能力無明顯損失，因此在環(huán)境中對抗性基因的富集將長期存在. 事實上，有學(xué)者指出微塑料老化或再生后含氧基團增多，反而有助于其對污染物的富集，如LIU等[27,37]報道指出老化后微塑料對親水性有機物與重金屬的富集能力增加.

2.4 微塑料粒徑與濃度對富集抗性基因的影響

微塑料粒徑對富集抗性基因的影響如圖3所示. 結(jié)果表明，粒徑對微塑料富集抗性基因的影響顯著，粒徑越小的微塑料富集的抗性基因越多. 粒徑為0.1 mm的微塑料對胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的富集濃度分別達1.65×1014和7.20×1013copies/g，相比于1.5 mm的微塑料分別提高了25.9與7.9倍. 分析微塑料比表面積與富集濃度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者呈顯著正相關(guān)(胞內(nèi)抗性基因、胞外抗性基因富集濃度與微塑料粒徑的R2分別為0.985與0.968). 顯然，相同濃度的微塑料投入污水中，粒徑越小的微塑料總表面積越大，意味著與水中ARGs互相接觸的概率增加. 該結(jié)果表明，微塑料排放至環(huán)境后，會經(jīng)過各種物理、化學(xué)作用，粒徑不斷變小，因此對抗性基因的富集能力將不斷增大，從而使其健康風(fēng)險更為嚴(yán)峻.

圖3 微塑料粒徑與濃度對富集抗性基因的影響Fig.3 Effects of MPs size and concentration on the enrichment of ARGs

微塑料濃度對富集抗性基因的影響分析〔見圖3(b)〕表明，在微塑料濃度為50 mg/L時，其對胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的富集濃度分別能達到3.83×1015與4.31×1014copies/g，隨著微塑料濃度的增加，其對ARGs的富集濃度逐漸減小. 從反應(yīng)過程來看，高濃度微塑料加入樣品中，微塑料之間的競爭關(guān)系導(dǎo)致每個微塑料與ARGs的接觸機會變少. 而事實上，當(dāng)微塑料濃度超過200 mg/L時，從試驗過程中觀察到微塑料之間容易團簇在一起，可能抑制了其與ARGs的接觸. 在實際污水廠中，微塑料濃度在不同研究中差異較大[7]，但一般低于筆者試驗所設(shè)濃度. 低濃度的微塑料給富集以良好的環(huán)境，能充分發(fā)揮其富集抗性基因的能力，從而加大了污染的風(fēng)險.

2.5 微塑料富集胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的動力學(xué)分析

考察微塑料對胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的富集動力學(xué)特征，結(jié)果(見圖4)表明，微塑料對胞內(nèi)抗性基因與胞外抗性基因的富集量均隨著時間的延長而增加，并逐漸趨于平緩，最終達到富集平衡. 對于胞外抗性基因在6 h時富集量達到了平衡富集量的80%，隨后富集速率逐漸降低，12 h達到平衡；對于胞內(nèi)抗性基因在4 h時已達到平衡富集量的80%，隨后富集速率逐漸趨于平衡.

圖4 接觸時間對塑料富集抗性基因的影響Fig.4 Effects of exposing time on the enrichment of ARGs by MPs

分別采用準(zhǔn)一級動力學(xué)模型和準(zhǔn)二級動力學(xué)模型對微塑料富集胞內(nèi)抗性基因和胞外抗性基因的特征進行模擬，參數(shù)如表2所示. 對于胞外抗性基因，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)(R2)大于準(zhǔn)一級動力學(xué)模型，且理論平衡富集量(8.75×1013copies/g)與實際平衡富集量(8.32×1013copies/g)更為接近，表明準(zhǔn)二級動力學(xué)模型能更準(zhǔn)確地描述微塑料對胞外抗性基因的富集過程，同樣對于胞內(nèi)抗性基因，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的R2為0.993，也大于準(zhǔn)一級動力學(xué)模型(R2=0.958)，前者更能準(zhǔn)確地描述胞內(nèi)抗性基因的富集過程. 有學(xué)者觀察到了相似的結(jié)果，如ZHANG等[38]擬合聚乙烯與聚苯乙烯對硝基多環(huán)芳烴(NPAHs)的富集動力學(xué)時發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)二級動力學(xué)模型更能準(zhǔn)確地描述整個富集過程. 比較2種形式抗性基因的準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的速率常數(shù)發(fā)現(xiàn)，胞外抗性基因的速率常數(shù)明顯高于胞內(nèi)抗性基因，表明微塑料對胞外抗性基因的富集速率比胞內(nèi)抗性基因更快.

表2 抗性基因富集的兩種動力學(xué)模型擬合參數(shù)

3 結(jié)論

a) 微塑料對污水中胞外抗性基因的富集倍數(shù)高于胞內(nèi)抗性基因，最高達后者的13.1倍.

b) 微塑料對二沉池出水中抗性基因的富集倍數(shù)顯著高于進水與活性污泥.

c) 3種微塑料對抗性基因的富集能力表現(xiàn)為聚丙烯>聚苯乙烯≈聚乙烯. 聚丙烯對抗性基因的富集能力最強，聚苯乙烯更容易富集胞外抗性基因，而聚乙烯更容易富集胞內(nèi)抗性基因. 聚乙烯再生對富集抗性基因的能力無顯著影響.

d) 污水中抗性基因在微塑料上的富集倍數(shù)與微塑料的粒徑、濃度均成反比.

e) 污水中抗性基因在微塑料上的富集過程遵循準(zhǔn)二級動力學(xué)模型，且胞外抗性基因的富集速率比胞內(nèi)更快.

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