羥基氧化鐵對(duì)太湖底泥中多氯聯(lián)苯微生物厭氧脫氯的影響

韓雪欣, 林娜娜, 劉 莎, 許 妍

東南大學(xué)土木工程學(xué)院， 江蘇 南京 210096

20世紀(jì)30年代至80年代曾廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)的多氯聯(lián)苯(PCBs)是一種典型的持久性有機(jī)物. PCBs因具有疏水性和難降解性，易通過食物鏈積累，從而對(duì)人體健康造成危害[1]. 研究顯示，PCBs具有致癌性、致突變性，同時(shí)會(huì)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響[2-4]. 此外，人體攝入PCBs還會(huì)增大患糖尿病、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5-6].

目前，傳統(tǒng)的PCBs修復(fù)方法有植物修復(fù)、好氧微生物降解、厭氧微生物脫氯、化學(xué)試劑脫氯等[7]. 其中，微生物降解法成本低、環(huán)境友好，具有較好的應(yīng)用前景[8-9]. 低氯代PCBs(氯原子取代數(shù)≤3)較易被好氧微生物降解[10]，但環(huán)境中大多存在的是較高氯代程度的PCBs，在一定程度上限制了好氧降解反應(yīng)的進(jìn)行. 微生物在厭氧環(huán)境下可將高氯代PCBs脫氯降解為低氯代產(chǎn)物，提高PCBs的原位修復(fù)潛力，因此得到日益廣泛的關(guān)注.

PCBs在厭氧條件下的脫氯速率、脫氯程度、脫氯歷程受到多種物理和化學(xué)因素的影響，目前關(guān)注較多的有溫度、pH、電子供體、電子受體、碳源等[17-18]. 在厭氧脫氯過程中，PCBs作為電子受體發(fā)生還原反應(yīng). 天然底泥中存在的Fe(Ⅲ)等電子受體與PCBs存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系. Morris等[19]首次研究了FeOOH對(duì)哈德遜河底泥中PCBs脫氯的影響，發(fā)現(xiàn)FeOOH使PCBs的脫氯程度降低了12%. WEI等[20-21]研究表明，F(xiàn)e(Ⅲ)與三氯乙烯(TCE)競(jìng)爭(zhēng)電子供體，可部分抑制脫氯作用. XU等[22]指出，F(xiàn)eOOH抑制了哈德遜河和格拉斯河底泥中PCBs的脫氯降解，同時(shí)對(duì)底泥中脫氯相關(guān)的Dehalococcoides菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了消極影響. 然而，LIU等[23]利用廣東省龍?zhí)梁恿髦械牡啄?，在研究生物電化學(xué)反應(yīng)器中Fe(Ⅲ)對(duì)PCB 61脫氯的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入Fe(Ⅲ)顯著提高了PCB 61的脫氯速率和脫氯程度. 楊文斌等[24]測(cè)定得到太湖沉積物中的Fe元素含量為 25 250～31 570 mg/kg，相較于國(guó)內(nèi)外的其他水域[25-28]，太湖底泥中Fe元素的含量較高. 因此，研究Fe(Ⅲ)對(duì)太湖底泥中PCBs厭氧脫氯和底泥微生物群落的影響具有實(shí)際意義.

該研究擬在太湖底泥微環(huán)境中添加PCBs和羥基氧化鐵(FeOOH)，探究競(jìng)爭(zhēng)性電子受體FeOOH對(duì)太湖底泥微環(huán)境下PCBs厭氧脫氯速率、脫氯程度的影響以及2種微環(huán)境(未添加FeOOH的對(duì)照組和添加了FeOOH的試驗(yàn)組)下PCBs脫氯過程中微生物群落的變化，以揭示太湖底泥PCBs脫氯降解潛能，為監(jiān)測(cè)自然衰減法原位修復(fù)PCBs提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：安捷倫7890A配微電子捕獲檢測(cè)器(GC-μECD，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；致微GI54DS高壓滅菌器(美國(guó)致微儀器公司)；N-12008旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì))；A-1000s水流抽氣泵(東京理化器械株式會(huì))；ZX3渦旋儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司).

試劑與藥品：正己烷(n-Hexane 95%)、丙酮(Acetone)、二氯甲烷(Dichloromethane)，均采購(gòu)自天地高純?nèi)軇┯邢薰?，均為色譜純；異丙醇(Isopropanol，色譜純)，采購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；弗羅里土(Florisil，60～80目)，采購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；無水硫酸鈉(Na2SO4)、氯化鈉(NaCl)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、四丁基硫酸氫銨(TBA)，均采購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司，均為分析純; PCB單體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及混標(biāo)采購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司.

1.2 樣品采集及處理

在太湖竺山灣布設(shè)4個(gè)采樣點(diǎn)(見圖1)，使用抓斗式采泥器采集表層(0～5 cm)底泥，在4 ℃下于棕色玻璃瓶中水封保存.

圖1 太湖底泥樣品采樣點(diǎn)分布示意Fig.1 The location of sediment sampling sites in Taihu Lake

取適量底泥于室溫20 ℃下自然風(fēng)干，剔除礫石、雜草等雜質(zhì)后充分研磨，過100目(150 μm)篩. 預(yù)處理后進(jìn)行底泥理化性質(zhì)的測(cè)定，測(cè)定方法及儀器見表1.

表1 底泥理化性質(zhì)測(cè)定方法及儀器

1.3 底泥微環(huán)境配制

表2 PCBs母體組成

T-1對(duì)照組的設(shè)置：在厭氧條件下于30 mL血清瓶中添加4.1 g濕泥(干質(zhì)量為2.0 g)、2.0 g外加PCBs的干泥和13.9 g新鮮配制的RAMM培養(yǎng)液(配制方法參照文獻(xiàn)[29-30])，泥漿總質(zhì)量為20 g，其中干泥和濕泥均為4個(gè)采樣點(diǎn)底泥等質(zhì)量混合所得. PCBs總含量為50 mg/kg(以泥漿計(jì)). T-Fe試驗(yàn)組同樣在血清瓶中添加4.1 g濕泥和2.0 g外加PCBs的干泥，然后加入0.696 mL FeOOH膠體儲(chǔ)備液(1.15 mol/L，配制方法參照文獻(xiàn)[31])，再加入適量RAMM培養(yǎng)液，使瓶?jī)?nèi)泥漿混合物總質(zhì)量為20 g，PCBs總含量為50 mg/kg，F(xiàn)eOOH含量為40 mmol/kg(以泥漿計(jì)). 滅菌組的配制方法同T-1對(duì)照組，但添加的濕泥需在121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌45 min，連續(xù)滅菌3 d. 血清瓶加塞特氟龍涂層灰丁基橡膠塞，并用鋁箔密封. 將配制好的血清瓶于100 r/min下振蕩混勻12 h. 振蕩完成時(shí)為第一個(gè)采樣點(diǎn)，記為第0天. 模擬底泥自然環(huán)境，將混勻的血清瓶置于避光條件下室溫〔(22±2)℃〕靜置反應(yīng). 0～168 d內(nèi)每21 d取樣1次，此后于第210天取樣1次，每次均采集3個(gè)平行樣，測(cè)定泥漿中二價(jià)鐵〔Fe(Ⅱ)〕的濃度，并進(jìn)行PCBs的提取與分析以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析.

1.4 Fe(Ⅱ)濃度的測(cè)定

使用菲洛嗪試劑測(cè)定體系中Fe(Ⅱ)的濃度[32]. 首先取0.2 mL泥漿，加入0.8 mL 1 mol/L的鹽酸充分反應(yīng)；離心(1 000 r/min，1 min)后取0.1 mL上清液，再加入4.9 mL菲洛嗪溶液，反應(yīng)后過濾. 使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定濾后溶液的吸光度. 該方法加標(biāo)回收率為97%～102%.

1.5 PCBs提純與分析

PCBs的提取、提純凈化及分析方法參照文獻(xiàn)[33]：在2.0 g泥漿中加入10 mL丙酮萃取1次，10 mL丙酮、正己烷混合液(二者體積比1∶1)萃取2次，再用3 mL正己烷萃取1次，將萃取液合并. 向萃取液中加入8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈉溶液，然后分離提純正己烷層，并氮吹至2 mL. 向氮吹后的正己烷溶液中加入1 mL四丁基硫酸試劑和2 mL異丙醇除硫，渦旋1 min，再加入0.1 g亞硫酸鈉. 分離正己烷層，并氮吹至1 mL，液體過弗洛里土層析柱(由上至下裝填1.8 g無水硫酸鈉和3.0 g弗洛里土，10 mm內(nèi)徑). 然后用30 mL正己烷洗脫，再用30 mL體積比為4∶1的正己烷和二氯甲烷混合液洗脫. 將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至4 mL，正己烷定容至8 mL，用于氣相色譜分析. 209種PCBs單體的氣相色譜分析使用安捷倫7890A配微電子捕獲檢測(cè)器(GC-μECD)進(jìn)行. 在采樣的泥漿中加入200 μL 5 μg/mL的PCB 209作為替代物，各PCB單體的濃度均通過替代物回收率校正.

1.6 16S rDNA的提取與qPCR分析

使用美國(guó)MoBio公司的PowerSoil DNA提取試劑盒提取底泥DNA，提取方法參照試劑盒說明書. 該試驗(yàn)分析了重要的脫氯細(xì)菌Dehalococcoides16S rRNA 基因數(shù)量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，從而定量表現(xiàn)其在兩種微環(huán)境下PCBs脫氯過程中的變化規(guī)律. 目標(biāo)菌群研究使用的引物為DHC1200F/DHC1271R[34]. 質(zhì)粒委托上海生工進(jìn)行制備，采用pUCm-T載體插入目標(biāo)基因. qPCR的反應(yīng)體系為25 μL. 循環(huán)條件：95 ℃ 預(yù)變性120 s；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解程序設(shè)置為60～95 ℃.

1.7 高通量測(cè)序分析

底泥樣品總DNA提取方法同1.6節(jié)，高通量測(cè)序工作委托廣州美格基因公司完成，使用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序. 使用QIIME軟件包(版本1.9.1)計(jì)算兩種多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù))，比較群落物種多樣性. 以Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)為參照，使用RDP Classifier對(duì)每個(gè)OTU(operational taxonomic unit，操作分類單位)的代表序列進(jìn)行物種分類，并用R軟件(版本2.15.3)統(tǒng)計(jì)OTU各分類等級(jí)所占比例，繪制成柱形圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 太湖底泥理化性質(zhì)分析

太湖地區(qū)4個(gè)采樣點(diǎn)底泥樣品的含水率為38.86%～62.71%，F(xiàn)e含量為 24 930.46～34 882.2 mg/kg(以該試驗(yàn)微環(huán)境中的泥漿計(jì)，為89.04～124.58 mmol/kg)，總有機(jī)碳(TOC)含量為0.52%～1.27%(以干泥計(jì))，PCBs背景值為13～84 ng/g(以干泥計(jì)). 根據(jù)加拿大《沉積物環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，Z3、Z4采樣點(diǎn)底泥中PCBs含量低于ISQG，其所在區(qū)域內(nèi)PCBs對(duì)生物體的威脅在可接受范圍內(nèi)；Z1、Z2采樣點(diǎn)底泥PCBs背景值介于ISQG與PEL(可能效應(yīng)水平值，277 ng/g)之間，其所在區(qū)域內(nèi)PCBs對(duì)生物體存在潛在威脅，這與袁旭音等[35]對(duì)太湖沉積物PCBs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果相一致.

2.2 PCBs厭氧脫氯結(jié)果分析

2.2.1PCBs脫氯速率及脫氯程度分析

微環(huán)境中總PCBs質(zhì)量濃度的變化可直觀地反映其脫氯情況. 在210 d的反應(yīng)周期內(nèi)，滅菌組總PCBs質(zhì)量濃度維持在(49.03±0.48)mmol/kg范圍內(nèi)，隨時(shí)間無顯著變化，且無脫氯產(chǎn)物被檢測(cè)到，證明脫氯是微生物過程. T-1對(duì)照組與T-Fe試驗(yàn)組中總PCBs質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化情況(見圖2)顯示，2種反應(yīng)條件下均有脫氯反應(yīng)的發(fā)生. T-1對(duì)照組中，反應(yīng)滯后期約為21 d，21～126 d為PCBs快速降解期，126～210 d脫氯速率減慢，但仍未到達(dá)平臺(tái)期，表明210 d后，太湖底泥微環(huán)境中仍存在PCBs脫氯潛能. 在210 d內(nèi)，T-Fe試驗(yàn)組中PCBs的脫氯效率遠(yuǎn)低于T-1對(duì)照組，反應(yīng)滯后期較長(zhǎng)，為42～63 d. 至第210天，T-1對(duì)照組的總PCBs質(zhì)量濃度降低了13.38%，而T-Fe試驗(yàn)組僅降低了4.80%. 這表明Fe(Ⅲ)對(duì)PCBs的還原脫氯具有一定的抑制作用，降低了脫氯程度與脫氯速率，但并未完全抑制，這與XU等[22]對(duì)格拉斯河底泥的研究結(jié)果相同. 哈德遜河底泥中TOC含量與太湖底泥相近，F(xiàn)e元素背景值(5 310 mg/kg)遠(yuǎn)低于太湖底泥，但添加相同濃度的FeOOH使哈德遜河底泥中的PCBs厭氧脫氯反應(yīng)完全被抑制[22]，表明Fe(Ⅲ)對(duì)PCBs脫氯的影響是一個(gè)復(fù)雜的作用過程，受到諸多物理化學(xué)和生物因素的共同影響.

圖2 微環(huán)境中總PCBs質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化Fig.2 Total PCBs mass concentrations over time in the microcosms

根據(jù)在PCBs上的位置，氯可以分為3類——鄰位(ortho-)、對(duì)位(para-)、間位(meta-)氯，這3種氯隨時(shí)間的變化情況見圖3. 由圖3可知，T-1對(duì)照組中，間位(meta-)氯的脫氯滯后期短(21～42 d)，脫氯速率快. 在T-Fe試驗(yàn)組中，間位氯在第147天才開始減少，第210天時(shí)的脫氯程度也遠(yuǎn)低于T-1對(duì)照組(T-1對(duì)照組為27.2%，T-Fe試驗(yàn)組為8.9%). 0～210 d內(nèi)，對(duì)位(para-)氯在T-1對(duì)照組中減少了17.9%，但在T-Fe試驗(yàn)組中僅減少了4.9%. 由此可見，F(xiàn)eOOH顯著抑制了間位和對(duì)位氯的脫除(P<0.05). XU等[22]則指出，在格拉斯河底泥中，F(xiàn)eOOH顯著抑制了對(duì)位氯的脫氯作用，但對(duì)間位脫氯的抑制非常有限. 底泥理化性質(zhì)和微生物群落均可能是導(dǎo)致上述研究結(jié)果存在差異的原因. 在T-1對(duì)照組和T-Fe試驗(yàn)組中每聯(lián)苯平均鄰位氯原子數(shù)目(OCPB)略有上升，主要原因是PCB 12的完全脫氯導(dǎo)致了PCBs分子數(shù)量的減少. 在兩種微環(huán)境中的脫氯偏好順序均是間位(meta-)>對(duì)位(para-)>鄰位(ortho-)，說明FeOOH并未改變PCBs的脫氯偏好. WEI等[20]研究顯示，氨三乙酸絡(luò)合Fe(Ⅲ)也未使三氯乙烯的脫氯偏好產(chǎn)生明顯變化，但水羥合鐵使三氯乙烯的脫氯子產(chǎn)物分布發(fā)生了較大改變，表明Fe(Ⅲ)的種類也會(huì)對(duì)脫氯偏好產(chǎn)生影響.

圖3 每聯(lián)苯平均鄰位(ortho-)、間位(meta-)、對(duì)位(para-)氯數(shù)目隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes of ortho-, meta-, para- chlorines per biphenyl over time

2.2.2PCBs產(chǎn)物分析

滅菌組在210 d的反應(yīng)周期內(nèi)未檢測(cè)到PCBs脫氯產(chǎn)物，表明無脫氯反應(yīng)發(fā)生. T-1對(duì)照組中，第42天開始出現(xiàn)9種母體外的子產(chǎn)物，說明脫氯啟動(dòng)于21～42 d期間. T-Fe試驗(yàn)組中第63天檢測(cè)到脫氯產(chǎn)物，表明T-Fe試驗(yàn)組的脫氯滯后期為42～63 d. 這也與圖2中總PCBs質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)一致. 由此可見，F(xiàn)eOOH使脫氯滯后期延長(zhǎng)，這與Paul等[21]的研究結(jié)果相同.

初始狀態(tài)(第0天)與反應(yīng)進(jìn)行至第210天時(shí)，T-1對(duì)照組與T-Fe試驗(yàn)組中PCB單體的組成分布如圖4所示. 結(jié)果表明，第210天時(shí)，T-1對(duì)照組中，5種高氯代的PCBs母體(PCB 105、PCB 114、PCB 149、PCB 153、PCB 170)降解程度較高，PCB 1(2-)、PCB 2(3-)、PCB 13(3-4)、PCB 25(24-3)、PCB 32(26-4)、PCB 47(24-24)、PCB 49(24-25)、PCB 52(25-25)等低氯代的子產(chǎn)物大量累積. 這些子產(chǎn)物聯(lián)苯上剩余的氯原子均無側(cè)位氯取代，表明存在側(cè)位氯的氯原子較易被脫除，而無側(cè)位氯的氯原子較難被取代. T-Fe試驗(yàn)組中，5種高氯代的PCBs母體的降解程度較低，積累的低氯代子產(chǎn)物的種類及其濃度也低于T-1對(duì)照組，其中PCB 32、PCB 47、PCB 49、PCB 52的濃度遠(yuǎn)低于T-1對(duì)照組.

注：含量低于0.1 mg/kg的PCB單體不顯示編號(hào). 圖4 第0天與第210天微環(huán)境中PCB單體組成分布對(duì)比Fig.4 Comparison of the PCB congener profile at day 0 and day 210 in the microcosms

微環(huán)境中PCBs的主要脫氯路徑見圖5. 如圖5所示，PCB 32是PCB 64和PCB 71的一代子產(chǎn)物，與T-1對(duì)照組相比，T-Fe試驗(yàn)組中PCB 64的降解程度明顯較低，這可能是PCB 32在T-Fe試驗(yàn)組中未大量積累的原因. PCB 47、PCB 49、PCB 52是PCB 153的二代子產(chǎn)物，而FeOOH抑制了PCB 153的降解，因此使子產(chǎn)物的濃度較低. 值得注意的是，T-1對(duì)照組中出現(xiàn)了PCB 25的鄰位脫氯子產(chǎn)物PCB 13，表明太湖底泥中具有鄰位脫氯路徑. 而T-Fe試驗(yàn)組中未檢測(cè)到PCB 13，無鄰位脫氯過程，這可能是因?yàn)镕e(Ⅲ)抑制了鄰位脫氯進(jìn)程. 然而，XU等[22]發(fā)現(xiàn)，添加FeOOH并未抑制格拉斯河底泥中的鄰位脫氯過程，這可能與格拉斯河底泥中有機(jī)物含量較高(TOC為5.73%)有關(guān).

注：ortho-—鄰位脫氯; meta-—間位脫氯; para-—對(duì)位脫氯. 虛線框表示外加PCB母體.圖5 微環(huán)境中多氯聯(lián)苯的主要脫氯路徑Fig.5 The main dechlorination pathways of PCBs in the microcosms

2.3 Fe(Ⅲ)還原分析

Fe(Ⅲ)的還原程度可通過微環(huán)境中Fe(Ⅱ)的濃度予以反映，兩個(gè)體系中Fe(Ⅱ)的濃度變化如圖6 所示. T-1對(duì)照組中Fe(Ⅱ)濃度的增加來源于太湖底泥中內(nèi)源Fe(Ⅲ)的還原，T-Fe試驗(yàn)組中則為內(nèi)源和外加Fe(Ⅲ)還原的共同結(jié)果. 因此，T-Fe試驗(yàn)組和T-1對(duì)照組中Fe(Ⅱ)濃度的差值可反映外加FeOOH的還原程度. 第21天時(shí)，T-Fe和T-1中Fe(Ⅱ)含量的差值為11.50 mmol/kg，說明FeOOH的還原已于0～21 d啟動(dòng)，優(yōu)先于PCBs還原脫氯反應(yīng). 至第210天，T-1對(duì)照組和T-Fe試驗(yàn)組中Fe(Ⅱ)含量的差值始終小于40 mmol/kg，說明T-Fe試驗(yàn)組中外加的FeOOH未完全被還原. 由此可見，PCBs脫氯與Fe(Ⅲ)還原可同時(shí)進(jìn)行. WEI等[20]的研究同樣表明三氯乙烯脫氯和Fe(Ⅲ)還原可同時(shí)發(fā)生.

圖6 兩個(gè)微環(huán)境體系中Fe(Ⅱ)濃度隨時(shí)間的變化Fig.6 The concentration of Fe (Ⅱ) over time in the two microcosms

2.4 高通量測(cè)序結(jié)果分析

該試驗(yàn)對(duì)第0、42、168天兩組微環(huán)境中底泥樣品的16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序. 序列相似度≥97%則歸為1個(gè)OTU，各樣品的序列數(shù)及OTU數(shù)見表3. Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)可以綜合反映群落中物種的豐富度和均勻度，二者值越大，表明群落多樣性越高. 由表3可見，初始狀態(tài)底泥樣品中微生物群落多樣性最高，兩組的微生物群落多樣性均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，且T-Fe試驗(yàn)組的群落多樣性低于同時(shí)段的T-1對(duì)照組.

表3 各樣品OTUs及α-多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

各組底泥中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度如圖7所示. 由圖7可見，第0天時(shí)T-1對(duì)照組中，變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度(46.46%)最高，其次為擬桿菌門(Bacteroidete，相對(duì)豐度為16.57%)、綠彎菌門(Chloroflexi，相對(duì)豐度為9.64%)、厚壁菌門(Firmicutes，相對(duì)豐度9.62%). 添加PCBs后，T-1對(duì)照組中厚壁菌門的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，在第168天時(shí)達(dá)37.71%，成為群落中相對(duì)豐度最高的門類，這與楊凱[36]的研究結(jié)果一致. T-Fe試驗(yàn)組中厚壁菌門的相對(duì)豐度呈更加明顯的升高趨勢(shì)，第168天時(shí)達(dá)55.95%，同樣在微環(huán)境群落中占比最高. 楊凱[36]指出，厚壁菌門的大量富集表明該門類中可能存在與PCBs轉(zhuǎn)化和消減密切相關(guān)的微生物.

圖7 門水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化Fig.7 Changes of relative abundance of preponderant bacteria phyla over time

T-1對(duì)照組中，變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度隨脫氯反應(yīng)的進(jìn)行逐漸降低，第168天時(shí)占總細(xì)菌的27.72%，優(yōu)勢(shì)菌地位下降. T-Fe試驗(yàn)組的Fe(Ⅲ)還原條件下，變形菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)更加明顯的下降趨勢(shì)，第168天時(shí)占比僅為14.96%. 雖然變形菌門在各體系中的相對(duì)豐度降低，但δ變形菌亞門(δ-Proteobacteria)在變形菌門內(nèi)的占比呈上升趨勢(shì)，T-1對(duì)照組中由第0天的31.43%增至第168天的53.65%，T-Fe試驗(yàn)組中第168天時(shí)其占比達(dá)61.95%.δ-Proteobacteria中的脫硫單胞菌屬(Desulfuromonas)、脫硫細(xì)菌屬(Desulfuromusa)、地桿菌屬(Geobacter)和幽門桿菌屬(Pelobacter)可作用于Fe(Ⅲ)還原[37]，部分Fe(Ⅲ)還原菌可使三氯乙烯、四氯乙烯脫氯降解[38-40]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)使PCBs厭氧脫氯的鐵還原菌.

目前已知的PCBs脫氯菌大多隸屬于綠彎菌門(Chloroflexi)[41-43]，其相對(duì)豐度在T-1對(duì)照組、T-Fe試驗(yàn)組中均有一定程度的提高，由第0天的9.64%分別增至第168天的11.57%和12.70%. 初始狀態(tài)下，Chloroflexi門類內(nèi)相對(duì)豐度最高的是厭氧繩菌綱(Anaerolineae，相對(duì)豐度為94.33%)，其次為Dehalococcoidetes(相對(duì)豐度為4.2%). T-1對(duì)照組中，已知與PCBs脫氯相關(guān)的Dehalococcoidales在Chloroflexi中的占比大幅提升，由第0天的3.42%增至第168天的26.27%. T-Fe試驗(yàn)組中Dehalococcoidales/Chloroflexi的增幅較小，第168天時(shí)比值為10.55%. 各微環(huán)境中，第0天時(shí)未啟動(dòng)脫氯反應(yīng)，Dehalococcoides也在各體系中未被檢出. T-1對(duì)照組在第42天檢出Dehalococcoides，占總OTUs的0.01%，但在T-Fe試驗(yàn)組仍未檢出，對(duì)應(yīng)該時(shí)間點(diǎn)下T-1對(duì)照組中脫氯反應(yīng)啟動(dòng)，而T-Fe試驗(yàn)組中PCBs脫氯仍處于滯后期. 在脫氯速率較快的第168天，T-1對(duì)照組、T-Fe試驗(yàn)組中Dehalococcoides的占比分別為0.78%和0.18%，表明該菌屬會(huì)隨時(shí)間發(fā)生富集，并對(duì)太湖底泥微環(huán)境中PCBs的厭氧脫氯具有重要作用，這與Matturro等[44]對(duì)意大利馬可波羅海洋底泥的相關(guān)研究結(jié)果相同.

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析

目前，已有研究發(fā)現(xiàn)的PCBs還原脫氯細(xì)菌主要是Dehalococcoides屬細(xì)菌[42-43]，各微環(huán)境下Dehalococcoides的16S rRNA基因數(shù)隨時(shí)間的變化情況如圖8所示. 由圖8可見，T-1對(duì)照組中Dehalococcoides16S rRNA的基因數(shù)從21～42 d開始明顯增長(zhǎng)，而21～42 d T-1對(duì)照組中的PCBs脫氯也開始啟動(dòng)，至210 d 16S rRNA基因數(shù)一直保持在較高水平，該時(shí)段內(nèi)的PCBs脫氯也具有較高的速率. 這表明太湖底泥沉積物中，Dehalococcoides的生長(zhǎng)與PCBs的還原脫氯密切相關(guān)，該結(jié)果與高通量測(cè)序的結(jié)論一致. T-Fe試驗(yàn)組中Dehalococcoides的16S rRNA基因數(shù)一直維持在較低水平，即使是在圖2所示脫氯速率較快的84～126 d，該基因水平仍無明顯增長(zhǎng). 這表明在太湖底泥沉積物中可能存在其他PCBs脫氯相關(guān)的細(xì)菌種群. 0～42 d T-Fe試驗(yàn)組中Dehalococcoides的基因數(shù)高于T-1對(duì)照組，該現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)于格拉斯河底泥[22]的研究中，其原因可能是一些三價(jià)鐵還原菌與氫氧化菌互營(yíng)共生或發(fā)酵產(chǎn)氫[45]，氫氣作為Dehalococcoides的首選電子供體，促進(jìn)了其在底泥微環(huán)境中的富集[46]，但此時(shí)T-Fe試驗(yàn)組中脫氯反應(yīng)并未啟動(dòng)，這可能是Dehalococcoides屬中的相關(guān)細(xì)菌利用Fe(Ⅲ)作為替代電子受體進(jìn)行生長(zhǎng)代謝導(dǎo)致的[47]. 63～210 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，與T-1對(duì)照組相比，T-Fe試驗(yàn)組中Dehalococcoides的基因數(shù)處于較低水平，這與哈德遜河底泥[22]中的結(jié)果相一致.

圖8 兩個(gè)微環(huán)境體系中Dehalococcoides的16S rRNA基因數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.8 Changes of Dehalococcoides 16S rRNA genes over time in the two microcosms

3 結(jié)論

a) 太湖底泥中PCBs背景值為13～84 ng/g，Z1、Z2采樣點(diǎn)所在區(qū)域內(nèi)PCBs對(duì)生物體存在潛在威脅.

b) 40 mmol/kg的FeOOH對(duì)PCBs的還原脫氯有一定的抑制作用，延長(zhǎng)了脫氯滯后期，降低了脫氯程度和脫氯速率.

d) FeOOH顯著抑制了間位和對(duì)位氯的脫除(P<0.05). 在兩種還原條件下的脫氯偏好均是間位(meta-)>對(duì)位(para-)>鄰位(ortho-)，說明FeOOH并未改變PCBs的脫氯偏好. 對(duì)照組中存在鄰位脫氯路徑，而FeOOH還原體系中210 d內(nèi)未發(fā)生鄰位脫氯，這可能是FeOOH抑制了鄰位脫氯進(jìn)程.

e) PCBs脫氯與Fe(Ⅲ)還原可同時(shí)進(jìn)行，但Fe(Ⅲ)還原先于PCBs脫氯反應(yīng)發(fā)生.

f) 培養(yǎng)過程中，兩個(gè)體系中的微生物多樣性均逐漸降低，且Fe(Ⅲ)還原條件下的生物多樣性低于對(duì)照組. 添加PCBs后，厚壁菌門成為2種微環(huán)境中相對(duì)豐度最高的門類，而變形菌門的優(yōu)勢(shì)地位下降. 此外，綠彎菌門的占比在對(duì)照組和FeOOH試驗(yàn)組中均有一定程度的提高.Dehalococcoides會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而富集，并對(duì)太湖底泥微環(huán)境中PCBs的厭氧脫氯具有重要作用. 太湖底泥沉積物中可能還存在其他PCBs脫氯相關(guān)的細(xì)菌種群.

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