基于土大黃苷定性定量檢測(cè)的大黃類中藥摻偽鑒定方法研究進(jìn)展

陳雪，辛杰,2，王振,2，張波,2

(1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.山東省魯南中藥材工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 276005)

大黃為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等多種功效，屬于臨床常用中藥材之一[1]。由于大黃市場(chǎng)需求量及消耗量均較大，利益驅(qū)使下易出現(xiàn)人為摻偽現(xiàn)象，再者大黃為多基源植物藥，且正品大黃與同屬偽品大黃[如華北大黃(R.franzenbachiiMunt.]、河套大黃(R.hotaoenseC.Y.Cheng et Kao)、藏邊大黃(R.emodiiWall.)、疏枝大黃(R.spiciformeRoyle等)在性狀及顯微特征方面較難鑒別，也容易造成客觀上的誤用、錯(cuò)用等現(xiàn)象發(fā)生[2]。因此，多種因素作用下導(dǎo)致市售大黃藥材或含大黃的中成藥中出現(xiàn)摻偽現(xiàn)象，如李敏等[3]對(duì)收集自25個(gè)廠家的3種大黃飲片共計(jì)60個(gè)批次樣品進(jìn)行質(zhì)量考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生大黃、酒大黃和熟大黃飲片的摻假率分別為50%、47%和41%，質(zhì)量問(wèn)題之大令人擔(dān)憂；又如樊寶娟等[4]對(duì)市售112批含大黃制劑中的大黃用料和15批大黃飲片真?zhèn)芜M(jìn)行抽檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)112批制劑中32批大黃投料摻偽，且15批大黃飲片中9批為偽品；可見(jiàn)大黃摻偽現(xiàn)象十分嚴(yán)重。因此，加強(qiáng)大黃類藥材真?zhèn)舞b定方法研究，對(duì)保障大黃的用藥安全性和有效性具有重要意義。

目前，大黃真?zhèn)舞b定方法主要有性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定和分子鑒定等多種方法，但性狀鑒定及顯微鑒定準(zhǔn)確性偏低，而分子鑒定則技術(shù)要求和檢測(cè)成本偏高，比較而言，理化鑒定則兼顧準(zhǔn)確性及可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中較為廣泛[2]。土大黃苷(rhaponticin，RHA)為二苯乙烯衍生物，主要存在于河套大黃、華北大黃、藏邊大黃、疏枝大黃等大黃屬植物中，自1990年版《中國(guó)藥典》首次明確指出RHA可作為真?zhèn)未簏S鑒定的指標(biāo)性成分以來(lái)，基于RHA定性定量檢測(cè)的大黃真?zhèn)舞b定方法得到了廣泛應(yīng)用[5]。

大黃類藥材種類繁多，包括大黃生藥、炮制品(酒大黃、熟大黃、大黃炭)以及含大黃的中藥制劑，據(jù)統(tǒng)計(jì)《中國(guó)藥典》2015年版共收載含大黃的制劑153種，占制劑總數(shù)的10.2%，且制劑中大黃的比重差異顯著[6]。繁雜的藥物種類和眾多的劑量差異，給大黃藥材及制劑中大黃投料的真?zhèn)舞b定帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。如何利用RHA的特異性來(lái)實(shí)現(xiàn)大黃原料的有效鑒定？顯然，藥典提供的薄層色譜法(TLC)尚不能完全解決這個(gè)問(wèn)題。因此，為充分發(fā)揮RHA在大黃類藥材真?zhèn)舞b定過(guò)程中的重要作用，本文分別對(duì)2000年1月-2020年1月發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，對(duì)RHA在大黃類藥材真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用做一綜述，以供參考。

1 TLC

TLC具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果直觀、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在有對(duì)照品的情況下可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定性檢測(cè)，在《中國(guó)藥典》的【檢查】項(xiàng)中應(yīng)用十分廣泛。對(duì)于大黃生藥及其飲片(包括炮制品)，《中國(guó)藥典》2015年版采用聚酰胺薄膜為固相載體，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸(30∶5∶5∶20∶0.1)為展開(kāi)劑，通過(guò)在365 nm紫外燈下檢識(shí)，以“在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，不得顯相同的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)”作為判斷真?zhèn)未簏S的依據(jù)[1]。

而對(duì)于含大黃的中藥方劑，由于處方中其他藥材的化學(xué)成分可能與RHA存在干擾，導(dǎo)致上述檢測(cè)條件無(wú)法實(shí)現(xiàn)RHA的良好分離，因此對(duì)于方劑中RHA的TLC鑒定方法在固相載體和展開(kāi)系統(tǒng)方面均有所變化?！吨袊?guó)藥典》2015年版僅明確了2個(gè)處方(九味肝泰膠囊和三黃片)中大黃類藥材要進(jìn)行RHA定性檢測(cè)[1]，相對(duì)于共計(jì)153個(gè)含大黃的處方來(lái)說(shuō)少之又少。鑒于此，本文收集整理了更多含大黃的制劑中RHA的TLC檢測(cè)方法(見(jiàn)表1)，以供法參考。

表1 TLC法檢測(cè)RHA在大黃類藥材及其制劑真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用

由表1可知，在含大黃的中藥復(fù)方制劑TLC檢測(cè)RHA研究中，硅膠G板為固相載體應(yīng)用較廣，而與之對(duì)應(yīng)的展開(kāi)系統(tǒng)以“三氯甲烷-甲醇-甲酸-水”為主；而以聚酰胺薄膜為固相載體的展開(kāi)系統(tǒng)以“甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸”為主。

2 高效液相色譜(HPLC)

TLC方法雖然簡(jiǎn)便易行，但部分學(xué)者研究顯示TLC存在色譜圖清晰度不足，辨識(shí)困難等問(wèn)題，且提出HPLC分離度更好、靈敏度更高，更適用于RHA的檢測(cè)，有利于大黃藥材的去偽存真[16]。近年來(lái)，多位學(xué)者基于HPLC技術(shù)開(kāi)展了針對(duì)正品大黃、偽品大黃及含大黃的中藥制劑中RHA的定性定量檢測(cè)方法研究。由于通過(guò)RHA的有無(wú)即可定性判斷大黃類藥材的真?zhèn)?，因此較多學(xué)者僅利用HPLC進(jìn)行RHA的定性檢測(cè)，但也有學(xué)者通過(guò)定量檢測(cè)同時(shí)結(jié)合主成分分析法來(lái)判斷大黃類藥材的真?zhèn)蝃17]，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 HPLC檢測(cè)RHA方法參數(shù)表

由于部分中成藥中大黃組分比例較小，導(dǎo)致即使投料為偽品的情況下直接采用HPLC仍無(wú)法檢測(cè)RHA是否存在。為解決這一問(wèn)題，Chen等[31]以Fe3O4為磁組件，RHA為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，苯乙烯為共聚單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，二甲亞楓為致孔劑，通過(guò)懸浮聚合法制備了磁性分子印跡聚合物，并將其用于富集中成藥提取液中的RHA，然后再利用HPLC進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法對(duì)RHA的最低檢測(cè)限達(dá)6.63 μg·L-1，檢測(cè)范圍為0.59～713.6 nmol·L-1，適用于闌尾消炎片、排毒養(yǎng)顏膠囊、大黃蟄蟲(chóng)膠囊和三黃片等中成藥中RHA的檢測(cè)。

3 超高液相色譜(UPLC)

與HPLC相比，UPLC靈敏度和分離效率更高，檢測(cè)速度更快。任偉光等[32]以ACQUITY BEH C18色譜柱為分析柱，采用梯度洗脫的方式，建立了同時(shí)檢測(cè)大黃樣品中包括RHA在內(nèi)的8種化合物的UPLC檢測(cè)方法。該方法分析效率高，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在9 min內(nèi)完成，其中RHA的檢測(cè)范圍為2.02～129.44 μg·mL-1。

4 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)

LC-MS結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)LC實(shí)現(xiàn)化合物分離，然后通過(guò)MS的離子峰信息(包括一級(jí)、二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜離子峰)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性鑒別，其靈敏度和準(zhǔn)確性更高。

孫愛(ài)萍等[33]采用LC-MS/MS技術(shù)建立了中成藥麻仁丸中偽品大黃RHA的定性檢測(cè)方法，其中HPLC條件為：資生堂C18色譜柱，流動(dòng)相為0.01 mol·L-1醋酸銨-乙腈(40∶60)；MS采用ESI-離子源。測(cè)試結(jié)果顯示：RHA對(duì)照品保留時(shí)間為26 min，準(zhǔn)分子離子[M-H]-峰為m/z 419，主要碎片離子m/z為257和241。通過(guò)與對(duì)照品離子峰對(duì)比檢測(cè)，受驗(yàn)14批麻仁丸中有10批檢測(cè)到RHA，即說(shuō)明投料摻有偽品大黃。

楊萍等[34]則以ESI+為離子源，建立了中成藥一清顆粒中RHA的定性檢測(cè)方法，結(jié)果顯示RHA的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z為421，二級(jí)質(zhì)譜離子掃描RHA碎片離子峰m/z包括259、227、199和135。

此外，LC-MS在RHA的藥代動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。Zhao等[35]通過(guò)UHPLC-DAD-MSn技術(shù)確認(rèn)了RHA([M+H]+m/z 421)的代謝產(chǎn)物為丹葉大黃素(RPG，[M+H]+m/z 259；二級(jí)m/z 241、226.9、199、149、135、107.1)；并基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)建立了RHA和RPG在大鼠血清中的檢測(cè)方法。

以上研究可知，LC-MS檢測(cè)RHA的定性主要依據(jù)離子峰信息為RHA的一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰和RPG相關(guān)的二級(jí)離子峰信息。

5 毛細(xì)管電泳法(CE)

尚小玉等[36]建立了快速分離大黃類藥材中大黃酚、大黃素、大黃酸和RHA等4種成分的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MECC)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化后(緩沖液為50 mmol·L-1H3BO3-NaOH含緩沖液為20 mmol·L-1SDC，pH 10，分析電壓17 kV)，可在5 min內(nèi)完成4種成分的全部分離。然后其通過(guò)環(huán)糊精修飾對(duì)MECC進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，建立了基于環(huán)糊精修飾的混合MECC內(nèi)標(biāo)定量法用于分離、測(cè)定大黃類藥材中的6種化學(xué)成分，在最優(yōu)條件下(緩沖液為20 mmol·L-1硼砂緩沖液含20 mmol·L-1SDC，20 mmol·L-1STC和15 mmol·L-1β-環(huán)糊精，pH 10.5～11.1，分析電壓17 kV)，RHA檢測(cè)范圍為5～80 μg·mL-1，整個(gè)分析時(shí)間在25 min以內(nèi)[37]。

Yang等[38]利用β-環(huán)糊精作為調(diào)節(jié)劑，建立了RHA、RPG及兩者異構(gòu)體分離檢測(cè)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)，該方法可在3 min內(nèi)完成樣品分析，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度法和核磁共振檢測(cè)分離后的樣品，證實(shí)該CZE準(zhǔn)確高效。

6 化學(xué)發(fā)光測(cè)定法(CLA)

在硫酸酸性介質(zhì)條件下，高錳酸鉀可以直接氧化RHA而產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，基于此，木合塔爾·吐?tīng)柡榈萚39]結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立了一種快速準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便的RHA含量測(cè)定方法，該CLA對(duì)RHA的檢測(cè)限和定量限分別為0.2 ng·mL-1和0.6 ng·mL-1。

7 結(jié)語(yǔ)

作為大黃類藥材的真?zhèn)舞b定特異性成分，RHA的主要定性定量檢測(cè)方法包括TLC、HPLC、UPLC、LC-MS、CE和CLA等，其中TLC對(duì)飲片類藥材及含大黃組分較多的中成藥的鑒定可以取得理想效果，且方法簡(jiǎn)便快速；但對(duì)于大黃用量較低的中成藥的RHA檢測(cè)仍需借助HPLC、UPLC或LC-MS進(jìn)一步驗(yàn)證，或檢測(cè)前進(jìn)行RHA的富集。此外，CE法在RHA的分離與檢測(cè)方面十分高效，具有較好的開(kāi)發(fā)潛力。對(duì)于CLA法，其在中藥的復(fù)雜基質(zhì)中能否實(shí)現(xiàn)RHA的準(zhǔn)確檢測(cè)還有待進(jìn)一步研究。

中藥質(zhì)量好壞是保障臨床安全有效的關(guān)鍵，中藥鑒定的核心任務(wù)之一即是確保藥材的真實(shí)性，目前中藥鑒定已由傳統(tǒng)鑒定手段向現(xiàn)代鑒定技術(shù)發(fā)展，且發(fā)展十分迅速，然而基于化學(xué)成分鑒定仍是目前主流鑒定依據(jù)之一，而真?zhèn)舞b定特異性成分是眾多鑒定工作者苦苦尋覓的目標(biāo)，但是可遇而不可求。但對(duì)于大黃這一臨床應(yīng)用廣泛且制劑豐富的具體藥物而言，RHA是藥典已確認(rèn)的真?zhèn)舞b定指標(biāo)化合物，因此，應(yīng)充分利用RHA的特異性深入開(kāi)發(fā)大黃及含大黃的中藥制劑的真?zhèn)舞b定技術(shù)，進(jìn)一步完善藥典標(biāo)準(zhǔn)。建議：①針對(duì)藥典中收載的所有含大黃的中藥制劑首先利用TLC法進(jìn)行RHA檢測(cè)，建立TLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；②對(duì)于TLC無(wú)法確認(rèn)的，可進(jìn)一步建立HPLC或LC-MS技術(shù)鑒定RHA；③開(kāi)發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)且操作簡(jiǎn)便的RHA快速檢測(cè)技術(shù)(如基于免疫檢測(cè)原理的可視化試紙條技術(shù))，以達(dá)到廣泛適用和現(xiàn)場(chǎng)化鑒定的需求。