川芎嗪對成纖維細胞增殖及TGF-β1和bFGF表達的影響

王楠 許良 吳國明

[摘要]目的：研究川芎嗪對體外培養(yǎng)大鼠成纖維細胞增殖及堿性成纖維細胞因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）表達的影響，從而探討川芎嗪抑制瘢痕形成的作用機制。方法：體外分離培養(yǎng)大鼠皮膚成纖維細胞，采取MTT法及熒光染色檢測不同濃度的川芎嗪對大鼠成纖維細胞增殖能力的影響，ELISA法測定大鼠皮膚瘢痕成纖維細胞TGF-β1和bFGF的表達量。結(jié)果：在三種川芎嗪濃度條件下（1mg/ml，10mg/ml，50mg/ml），大鼠皮膚成纖維細胞增殖能力有不同程度的抑制作用，抑制作用與川芎嗪濃度成正比，在50mg/ml濃度時，抑制作用最為明顯。采用ELISA法測定培養(yǎng)上清TGF-β1和bFGF的分泌量，發(fā)現(xiàn)實驗組兩者含量均明顯低于對照組，其中濃度為50mg/ml時，含量最低（P<0.05）。結(jié)論：川芎嗪能夠明顯抑制體外培養(yǎng)的大鼠皮膚成纖維細胞的增殖能力，降低TGF-β1和bFGF的表達量，從而在一定程度上抑制大鼠皮膚成纖維細胞的活性。

[關(guān)鍵詞]川芎嗪;皮膚;成纖維細胞;瘢痕;轉(zhuǎn)化生長因子β1;堿性成纖維細胞因子

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）05-0056-03

Effect of Ligustrazine on Fibroblast Proliferation and the Expression of TGF-β1 and bFGF in Fibroblasts

WANG Nan，XU Liang，WU Guo-ming

（Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University，Hangzhou 311201，Zhejiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the influence of ligustrazine on the proliferation and expresson of TGF-β1 and bFGF for human normal and hypertrophic scar dermal fibroblasts cultured in vitro and to explore the relevant mechanism. Methods? The rat skin fibroblasts were isolated and cultured in vitro， and MMT assay was used to detect the effects of ligustrazine at various concentrations on the rat skin scar fibroblasts in vitro. ELISA was carried out to determine the contents of TGFβ1 and bFGF in rat skin scar fibroblasts. Results? Under 3 ligustrazine concentrations （1mg/ml， 10mg/ml， 50mg/ml）， the rat skin fibroblasts were suppressed to various degrees， and such suppression was positively correlated with concentration. Typically， the most obvious suppression was attained at the concentration of 50mg/ml. Besides， TGF-β1 and bFGF contents were measured by ELISA， the results suggested that， the expression contents in experiment group were lower than those in control group， and the lowest contents were detected at the concentration of 50mg/ml （P<0.05）. Conclusion? Ligustrazine markedly suppresses the activity of rat skin fibroblasts cultured in vitro， and reduces the TGF-β1 and bFGF contents. Typically， the efficacy peaks under a relatively suitable concentration， thus partially suppressing the activity of rat fibroblasts.

Key words： ligustrazine; skin; fibroblasts; scar; transforming growth factor-β1（TGF-β1）; basic fibroblast growth factor（bFGF）

外傷所致皮膚損傷（尤其深度燒傷）愈合后形成增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）的現(xiàn)象極為常見[1]。瘢痕不但影響美觀，嚴(yán)重時還可導(dǎo)致局部畸形或功能障礙，從而給患者后期治療造成沉重的經(jīng)濟和心理負擔(dān)[2]。病理性瘢痕作為皮膚損傷最常見的并發(fā)癥之一，一直是外科修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題;抑制皮膚增生性瘢痕的生長及纖維化病變的進展，是近年研究的焦點[3]。盡管臨床治療瘢痕的方法眾多（如手術(shù)治療、放射治療、藥物治療等），但療效都并不盡如人意[4]。川芎嗪是臨床上廣泛使用的一種心腦血管藥物，具有改善血液流變學(xué)和清除氧自由基的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪有抑制皮膚增生性瘢痕生長的藥理作用，且臨床上已將其用于預(yù)防燒傷后瘢痕的形成[6]。中藥及中藥制劑治療，不僅能開拓臨床診療思路，更能有效防治局部瘢痕生長，且能合理降低醫(yī)療費用，尤其對燒傷后瘢痕的愈合有著十分顯著的效果[7]。本研究從細胞水平入手，旨在觀察川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞中TGF-β1和bFGF的影響，從而探討川芎嗪對抑制瘢痕形成的影響，為期增生性瘢痕預(yù)防藥物的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 材料：新生大鼠皮膚成纖維細胞（上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司）;四甲基偶氮唑鹽（MTT，Amresco公司）;二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）;TGF-β1和bFGF的ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Vimentin兔多克隆抗體及FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（北京碧云天生物技術(shù)有限公司），恒溫水浴槽（DK-600型，上海醫(yī)療器械五廠），臺式離心機（800型，上海手術(shù)器械廠），全自動酶標(biāo)儀（ELX800型，Bio-Tek公司）等。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞增殖能力的影響：精確稱量不同濃度的川芎嗪后加入定量的DMEM培養(yǎng)液。按濃度分為四組：對照組（0mg/ml）;1mg/ml組;10mg/ml組;50mg/ml組。每組6孔。先每孔加入l×l04個細胞，37℃、5% C02孵育12h，細胞貼壁后，棄掉培養(yǎng)液，對照組每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液600μl，其余各組每孔加入對應(yīng)濃度川芎嗪液600μl。培養(yǎng)48h后，每孔各加5mg/ml的MTT溶液40μl，培養(yǎng)4h，棄上清液，加入300μl DMSO，振蕩15min，用酶標(biāo)儀測490nm波長處各孔的吸光度（OD值）。

1.2.2 免疫熒光檢測川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞增殖能力的影響：細胞處理方法同1.2.1，每組3個重復(fù)，不同濃度川芎嗪處理48h后，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，5%BSA封閉30min，然后兔抗Vimtin多克隆抗體（1：200）4℃孵育過夜，PBS清洗3遍，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1：500）室溫孵育1h，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3 川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞TGF-β1和bFGF表達的影響：采用ELISA法測定各組細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1和bFGF含量，按濃度分為四組，對照組（0mg/ml）;1mg/ml組;10mg/ml組;50mg/ml組，每組6孔重復(fù)，具體藥物處理方法同上。處理結(jié)束后收集培養(yǎng)上清，4℃ 1 200rpm離心5min去掉細胞碎片，余下的液體進行ELISA檢測，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。操作結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450nm處測定樣品OD值，根據(jù)樣品吸光度值計算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05則視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞活性的作用：在不同濃度的川芎嗪作用下，免疫熒光檢測Vimentin陽性細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)隨著川芎嗪濃度的升高，陽性細胞數(shù)明顯減少（圖1A～D），MTT檢測盒檢測細胞活力，吸光度（OD）值逐漸下降。50mg/ml組對細胞增殖活性的抑制作用最明顯。川芎嗪濃度為1mg/ml，10mg/ml，50mg/ml時，根據(jù)吸光度（OD）值，計算各組的細胞活力分別為76.2±11.3，63.4±7.8，57.3±8.8，均低于對照組100.0±10.3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在川芎嗪濃度為50mg/ml時，差異最為明顯，對細胞活力的抑制作用最強（P<0.01）。

2.2 川芎嗪對大鼠皮膚成纖維細胞中TGF-β1和bFGF表達的影響：在體外川芎嗪作用下，大鼠皮膚成纖維細胞中TGF-β1和bFGF的表達呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，抑制作用與川芎嗪濃度成正比。50mg/ml組抑制作用最強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

bFGF對血管內(nèi)皮細胞有很強促進作用，可刺激成纖維細胞及皮膚平滑肌細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)血管新生，從而促進膠原纖維及彈力纖維合成。研究表明，bFGF可在創(chuàng)面愈合初期使成纖維胞的數(shù)量明顯增加[8]，不僅能顯著促進白細胞與單核細胞等炎性細胞吞噬細菌，而且能夠有效改善局部的組織環(huán)境使其有利于傷口的全面修復(fù)[9]。

TGF-β1作為啟動和終止組織修復(fù)的重要細胞因子，參與了創(chuàng)面愈合過程中上皮再生、間質(zhì)增生、成纖維細胞纖維化、膠原生成及血管形成等過程。研究表明，TGF-β1對炎癥細胞有趨化作用，能促進成纖維細胞形成[10]，TGF-β1受抑制后可減緩成纖維細胞增生，進而預(yù)防增生性瘢痕形成。TGF-β1與成纖維細胞的增殖、分化、遷徙、凋亡及膠原代謝等多種生理、病理過程密切相關(guān)[11]。

皮膚成纖維細胞作為創(chuàng)面愈合過程中的主要效用細胞，常表現(xiàn)為過度增殖和功能活躍，并能引起一系列反應(yīng)，造成創(chuàng)面修復(fù)失控，導(dǎo)致細胞外間質(zhì)的過多沉積和創(chuàng)傷的過度愈合，最終形成病理性瘢痕[12]?？梢?，皮膚成纖維細胞的功能異常及過度增殖在病理性瘢痕的增生中扮演著重要的角色。在藥物防治皮膚增生性瘢痕生長的攻堅戰(zhàn)中，中藥及中藥提取物因為其顯著的效果而廣受關(guān)注[13-14]。趙治偉等[15]通過研究川芎嗪注射液及丹紅注射液與可吸收生物膜聯(lián)合應(yīng)用預(yù)防組織粘連的有效性，證實三者的聯(lián)合應(yīng)用對于預(yù)防疏松結(jié)締組織粘連的效果明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用吸收生物膜。雷水生等[16]通過實驗發(fā)現(xiàn)川芎嗪能改變增生性瘢痕成纖維細胞形態(tài)和抑制其增殖，但并不影響其活力。研究證實，川芎嗪為一種新型鈣離子拮抗藥，可通過直接清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抑制成纖維細胞分裂和增殖，從而起到抗組織損傷和防治肺纖維化的作用，通過抑制肝脂質(zhì)過氧化、抑制星狀細胞活化增殖、降低膠原合成等途徑改善肝功能，因此川芎嗪有抑制皮膚增生性瘢痕生長的藥理作用。

本研究結(jié)果顯示，采用MTT法檢測，與對照組相比，實驗組細胞增殖延遲，生長活力下降，當(dāng)濃度為50mg/ml時，增殖活力抑制最為明顯，具有劑量依賴性，說明川芎嗪對于成纖維細胞的增殖有顯著的抑制作用。采用ELISA試劑法測定各組標(biāo)本TGF-β1和bFGF表達含量。發(fā)現(xiàn)在三種川芎嗪濃度條件下，和對照組相比，TGF-β1和bFGF表達含量均有不同程度的下降，并且下降程度與濃度成正比，作用效果具有濃度依賴性，當(dāng)濃度為50mg/ml時，抑制作用作為明顯。表明川芎嗪可在一定程度上抑制皮膚成纖維細胞中TGF-β1和bFGF的表達水平，從而減少皮膚成纖維細胞向瘢痕組織的轉(zhuǎn)化，避免大量瘢痕組織增生，對人體瘢痕的形成起到一定的抑制作用，其作用和功效值得進一步研究。

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[收稿日期]2020-05-08

本文引用格式：王楠，許良，吳國明.川芎嗪對成纖維細胞增殖及TGF-β1和bFGF表達的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（5）：56-58.