乳腺癌、胃癌HER-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)中液態(tài)陽性對(duì)照的制作和應(yīng)用

李 韜，羅依蔓，伏陽燕

四川綿陽四0四醫(yī)院病理科，四川綿陽 621000

免疫組織化學(xué)是目前病理科使用較多的鑒別診斷方法，但是在檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性、假陽性的情況。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，質(zhì)量控制必不可少。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)是乳腺癌[1-3]及胃癌[4-5]中最為重要的預(yù)后判斷因子，它是否存在陽性過表達(dá)與治療方案的制訂密切相關(guān)[6-7]，所以HER-2檢測(cè)中的陽性對(duì)照尤為重要。目前常用的陽性對(duì)照制作步驟比較煩瑣，不利于陽性對(duì)照的保存。本課題組選取了HER-2免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性的乳腺癌及胃癌組織制作液態(tài)陽性對(duì)照[8]，旨在解決上述問題。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 已知HER-2免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性的乳腺癌及胃癌組織[9]。

1.2方法

1.2.1組織前期處理 選取已知HER-2免疫組織化學(xué)染色呈強(qiáng)陽性的乳腺癌及胃癌組織，切片時(shí)注意避開纖維結(jié)締組織以及周圍正常組織，保留腫瘤細(xì)胞，切片厚度為4 μm。將上述切片放入50 mL離心管中，用玻璃棒將組織切片充分碾碎直到切片完全變成顆粒狀為止。向離心管中加入10 mL的脫蠟劑置于振蕩器上振蕩數(shù)秒，直至肉眼觀察石蠟完全溶解后離心，4 000 r/min離心5 min，倒掉脫蠟劑，重復(fù)該步驟兩次直到石蠟完全洗脫干凈。再向離心管中加入10 mL的無水乙醇后置于振蕩器上振蕩數(shù)秒后離心，4 000 r/min離心5 min，倒掉無水乙醇，重復(fù)該步驟兩次，以便充分洗掉脫蠟劑。

1.2.2液態(tài)對(duì)照制作 將上述沉淀轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入沉淀體積20倍的100%乙醇懸濁沉淀，懸濁液置于4 ℃保存待用，見圖1。

圖1 制作的液態(tài)陽性對(duì)照

1.2.3腫瘤細(xì)胞確定 將上述懸濁液吸取1～2 μL滴加載玻片上，充分烤片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)量,以及有無重疊現(xiàn)象，見圖2。

圖2 液態(tài)陽性對(duì)照的HE染色

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將上述懸濁液吸取1～2 μL滴加至陽離子防脫片載玻片上，干燥后于60 ℃烤箱中過夜。本科室使用丹科的PTLINK修復(fù)儀[10]及全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)[11]，按照設(shè)定的程序分別對(duì)液態(tài)對(duì)照的HER-2進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.5重復(fù)性驗(yàn)證 每隔15 d重復(fù)1.2.4步驟，3個(gè)月后對(duì)比每次染色的效果。

1.2.6實(shí)用性驗(yàn)證 將上述液態(tài)陽性對(duì)照同時(shí)用于腫瘤組織HER-2檢測(cè)結(jié)果的判讀。

2 結(jié) 果

3個(gè)月共進(jìn)行了6次免疫組織化學(xué)檢測(cè)，見圖3，發(fā)現(xiàn)液態(tài)陽性對(duì)照長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)HER-2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響，染色結(jié)果能夠保持較高的一致性，均為強(qiáng)陽性，在染色過程中組織沒有出現(xiàn)掉片情況。同時(shí)，將上述液態(tài)陽性對(duì)照用于腫瘤組織HER-2染色結(jié)果的判讀，從弱陽性至強(qiáng)性的結(jié)果均有，與已知的判讀結(jié)果符合。

圖3 液態(tài)陽性對(duì)照3個(gè)月內(nèi)不同時(shí)間的HER-2免疫組織化學(xué)染色

3 討 論

HER-2是表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族成員之一，具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，是重要的乳腺癌及胃癌預(yù)后判斷因子。HER-2的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的可靠性非常依賴于陽性對(duì)照的質(zhì)量，所以要做好免疫組織化學(xué)染色的質(zhì)控就是要做好陰、陽性對(duì)照。傳統(tǒng)的陽性對(duì)照獲取主要是依靠組織芯片法，組織芯片制作時(shí)會(huì)造成原有組織缺損的情況，多次制作時(shí)需要消耗大量的組織，對(duì)于病理科的標(biāo)本保存管理不利，并且做好的組織芯片量大且不易保存。液態(tài)陽性對(duì)照選用已知陽性的組織，切片后制作成細(xì)胞懸濁液，保存在1.5 mL的離心管中，易于保存，不會(huì)因切片造成組織浪費(fèi)。

液態(tài)陽性對(duì)照中的溶液為75%～100%乙醇，可根據(jù)科室實(shí)際情況選擇合適的乙醇濃度。若采用低濃度的乙醇制作液態(tài)陽性對(duì)照，其滴加于載玻片時(shí)散開非常快，如果滴加位置與實(shí)驗(yàn)組織距離很接近，則非常容易引起交叉污染，且組織保存時(shí)間不長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)導(dǎo)致組織蛻變而引起抗原丟失。若采用100%乙醇進(jìn)行液態(tài)陽性對(duì)照的制作時(shí)，滴加時(shí)乙醇非常容易揮發(fā)，組織細(xì)胞散開不嚴(yán)重，不易造成交叉污染，保存時(shí)間較長(zhǎng)，但是長(zhǎng)時(shí)間浸泡于100%乙醇中的組織會(huì)變得干、脆。如果一次制作的液態(tài)陽性對(duì)照量不多時(shí)可以使用100%乙醇，這樣制作的對(duì)照片效果最好，液態(tài)陽性對(duì)照不宜長(zhǎng)時(shí)間保存。本研究中的保存時(shí)間為3個(gè)月，對(duì)組織中的HER-2抗原沒有太大影響，但如果長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)引起組織中抗原的丟失[12]。所以建議液態(tài)陽性對(duì)照制作時(shí)需要根據(jù)科室實(shí)際工作量的情況來決定液態(tài)陽性對(duì)照制作量的多少，避免長(zhǎng)時(shí)間保存引起抗原丟失。

病理診斷中判讀乳腺癌、胃癌組織HER-2陽性染色的標(biāo)準(zhǔn)不一樣，但是乳腺癌、胃癌組織都可以用來制作液態(tài)陽性對(duì)照。除了HER-2抗體檢測(cè)以外，制作液態(tài)陽性對(duì)照的方法還能夠運(yùn)用于其他抗原/抗體的檢測(cè)。

液態(tài)陽性對(duì)照的出現(xiàn)對(duì)于病理檢查中免疫組織化學(xué)染色的質(zhì)控有很大的意義，讓陽性對(duì)照更加容易制作，方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用于實(shí)際工作中穩(wěn)定、可靠。