3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡及運動功能的影響

李長明 鄧小梅 周化騰 全仁夫

脊髓損傷一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，常見于高處墜落、交通外傷，且呈現(xiàn)發(fā)病率高、致殘率高的特點，常造成損傷平面以下的感覺、運動喪失，甚至癱瘓[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，中國有超過100 萬的脊柱脊髓損傷患者，且以每年12 萬的速度增長，不僅給患者帶來嚴重的身心負擔，同時也給家庭和社會形成了沉重的經(jīng)濟負擔[2]。目前關(guān)于修復(fù)受損神經(jīng)的研究越來越多，其中種子細胞+生物支架療法被證實可以有效促進脊髓損傷的修復(fù)[3-4]，但是其機制不明了，且細胞來源受到倫理學(xué)限制，難以擴大應(yīng)用范圍。因此，本實驗采用人尿液來源重編程誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）并分化為神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）吸附于3D 打印支架上，移植于脊髓受損區(qū)域，觀察其對大鼠運動神經(jīng)元凋亡及運動功能的影響，并探討其可能的機制。

1 實驗材料

1.1動物 選用雄性SD 大鼠42 只，SPF 級，體質(zhì)量200～250g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，給予足量的水和飼料，環(huán)境溫度23～25℃，相對濕度40%～60%，明暗光照12h/12h，分籠飼養(yǎng)。本研究經(jīng)倫理委員會審核，對動物處置方法符合相關(guān)倫理要求[倫理審查號：20170625182365]。

1.2主要試劑與儀器 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）（批號P133293）購于美國sigma 公司；山羊抗兔B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗體（批號BS1511）、山羊抗兔Bcl 相關(guān)X 蛋白（Bax）多克隆抗體（批號BS1725）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批號BS7004）均購于美國Bioworld 公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL）試劑盒（批號11684817910）購于中國羅氏生物公司。儀器包括熒光顯微鏡（型號CKX53）購于日本Olympus 公司；3D 打印機（型號Bio-Architect-Pro）購于中國杭州捷諾飛生物科技有限公司；可控性皮質(zhì)損傷撞擊儀（型號mode6.3）購于美國Custom Design 公司；手術(shù)器械購于中國江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。

2 實驗方法

2.1支架細胞預(yù)處理 將預(yù)先制備的3D 支架[5]截成2～3mm 的小段，置于干細胞培養(yǎng)基中浸泡48h后，在無菌操作臺中風(fēng)干，滅菌備用。按前期實驗方法制備人來源iPSCs[6]，并分離鑒定，并向NSCs 分化，將iPSCs-NSCs 細胞培養(yǎng)至第7 天時，消化計數(shù)，將1×106個細胞濃縮為0.2mL，滴于預(yù)處理過的支架上，置于培養(yǎng)箱中2h 后用于實驗?zāi)Ｐ椭苽渑c術(shù)后處理。

2.2實驗設(shè)計與分組 42 只SD 大鼠（SPF 級）按照隨機數(shù)字表法分為三組，每組14 只。采用改良Allen's 法通過可控性皮質(zhì)脊髓撞擊儀構(gòu)建脊髓損傷模型[7]。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，37℃恒溫下保溫，每天以crede 手法按壓排尿3 次，預(yù)防泌尿系統(tǒng)感染，術(shù)后3天以每天2 次的頻率腹腔注射相同劑量慶大霉素（8mg/kg）預(yù)防感染。1 周后進行實驗。麻醉后于T9-T10節(jié)段去除椎板，三組均切除損傷處脊髓2～3mm，給予不同干預(yù)措施。假手術(shù)組：只打開椎板；模型組：制作脊髓損傷模型，植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL；iPSCs-NSCs 組：植入載iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架預(yù)處理。模型成功標準[8]：術(shù)后即刻大鼠出現(xiàn)痙攣性擺動，擺尾反射、雙下肢遲緩性癱瘓，術(shù)后2h 進行Basso，Beattie and Bresnahan（BBB）評分評估小鼠后肢運動能力，BBB 評分為0 分時，則模型構(gòu)建成功。

2.3后肢運動功能恢復(fù)的行為學(xué)評估 在術(shù)后1、3、7、14、28 天，將大鼠放入開口箱子，輕敲箱壁，使其爬行，觀察動物運動距離，臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運動及其協(xié)調(diào)情況，每只大鼠觀察15min，對各組大鼠的運動能力進行BBB 評分測試，評估采取雙盲法，由熟悉BBB 評分量表的實驗人員進行。

2.4蘇木精-伊紅（HE）染色檢測脊髓損傷程度 各組動物均于干預(yù)8 周后處死，經(jīng)40g/L 多聚甲醛心臟灌注固定取脊髓組織樣本（T9-T10節(jié)段），PBS 清洗后置于40g/L 多聚甲醛中固定，再行脫水、包埋、切片等步驟，行HE 染色，鏡下觀察各組脊髓瘢痕和空洞面積，評價脊髓損傷程度。

2.5免疫組化檢測Bax、Bcl-2 變化 每只大鼠取3張切片，按SP 試劑盒說明書測定Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)性死亡蛋白（Bad）、Bax 的表達，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理、高溫修復(fù)、血清封閉、滴加一抗過夜（濃度為1∶150），并同時用PBS 代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20min、SABC 37℃孵育20min，繼而DAB 顯色，鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01mol/L PBS 漂洗3 次，每次5min，梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察脊髓組織變化。

2.6RT-PCR 檢測Caspase-3 mRNA 表達 采用RNA 自旋試劑盒說明書方法抽提總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系含4μL DNAse 處理過的RNA、Buffer 5μL、1μL dNTPs（10μM）、1μL Oligo （dT）、0.5μL 隨機引物（100μM）、1μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）、8.5μL DEPC H2O，共20μL。然后按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。30℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃ 5min。取出后在0.2mL PCR 管內(nèi)，依次加入1μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（RT 產(chǎn)物），各基因上游與下游引物各0.25μL，12.5μL PCR 反應(yīng)mix（Taq 酶，Taq buffer，dNTPs），用ddH2O 補足體積至25μL。按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，56℃/55℃/48℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，擴增35 個循環(huán)。用one-Dscan 圖像分析軟件分析目標條帶的灰度值。

從GenBank 獲得目的基因mRNA 的全長序列，利用引物和探針設(shè)計軟件Primer 5.0 設(shè)計引物序列。經(jīng)過Blast 分析，引物序列具有特異性。所用的引物及內(nèi)參照β-actin 引物見表1。引物均委托南昌中洪博元生物有限公司合成。

2.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.13D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù) 手術(shù)前所有大鼠BBB 評分均為21 分。假手術(shù)組因未損傷脊髓，術(shù)后BBB 評分均為21 分。術(shù)后1、3 天，模型組和iPSCs-NSCs 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后7、14、28 天，模型組和iPSCs-NSCs 組大鼠雙下肢運動功能均得到一定程度的恢復(fù)（P＜0.05），iPSCs-NSCs 組較模型組恢復(fù)更好（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠BBB 評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠BBB 評分比較（分，±s）

注：假手術(shù)組不做處理；模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL；iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架預(yù)處理；iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞；NSCs 為神經(jīng)干細胞；BBB 評分為Basso，Beattie and Bresnahan 行為評分法；與同組術(shù)后1 天比較，aP＜0.05；與同組術(shù)后3 天比較，bP＜0.05；與模型組同期比較，cP＜0.05

3.23D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 促進脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元修復(fù) 干預(yù)28 天后，HE 染色顯示假手術(shù)組脊神經(jīng)生長良好；模型組脊神經(jīng)受到損傷，組織水腫，細胞稀疏，細胞之間的間隙增大；iPSCs-NSCs 組細胞生長較模型組緊密，各組織生長間隙縮小，空泡減小，組織水腫消失。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織HE 染色結(jié)果（HE 染色×100）

3.33D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 抑制脊髓損傷大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達 免疫組化染色切片上，免疫陽性染色呈棕褐色。免疫組化結(jié)果顯示，在脊髓損傷后28 天，iPSCs-NSCs 組Bcl-2 陽性細胞的表達較模型組多（P＜0.05）；iPSCs-NSCs 組Bax 陽性細胞的表達較模型組少（P＜0.05）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax 陽性表達比較（個/mm2，±s）

表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax 陽性表達比較（個/mm2，±s）

注：假手術(shù)組不做處理；模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL；iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架預(yù)處理；iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞；NSCs 為神經(jīng)干細胞；Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2；Bax 為Bcl 相關(guān)X 蛋白質(zhì)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖2 各組大鼠脊髓神經(jīng)組織Bcl-2 和Bax 陽性表達情況（免疫組化×100）

RT-PCR 結(jié)果顯示，脊髓損傷術(shù)后28 天，iPSCs-NSCs 組Caspsase-3 mRNA 表達量較模型組少（P＜0.05），較假手術(shù)組無明顯改變（P＞0.05）。見圖3、表4。

表4 各組大鼠脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達量比較（±s）

表4 各組大鼠脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達量比較（±s）

注：假手術(shù)組不做處理；模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL；iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2～3mm 支架預(yù)處理；iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞；NSCs 為神經(jīng)干細胞；Caspase-3 為半胱氨酸蛋白酶-3；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

圖3 各組大鼠受損節(jié)段脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達情況

4 討論

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，種子細胞+生物支架療法因其類似于體內(nèi)正常組織中細胞-細胞外基質(zhì)間的動態(tài)相互作用，被越來越多地用于脊髓損傷修復(fù)研究[9-10]。張仁坤等[3]研究證實，3D 打印支架載NeuroDl 修飾的NSCs 能夠促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)環(huán)路的重建，對運動和感覺功能恢復(fù)有促進作用。曹宗銳等[4]利用膠原-硫酸肝素支架聯(lián)合神經(jīng)干細胞，促進大鼠脊髓損傷處神經(jīng)纖維的再生，改善大鼠雙側(cè)后肢運動功能。本研究通過3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 治療脊髓損傷大鼠，發(fā)現(xiàn)28 天后，iPSCs-NSCs組BBB 評分高于模型組（P＜0.05），且28 天后脊髓組織病理切片顯示iPSCs-NSCs 組細胞生長較模型組緊密，各組織生長間隙縮小，空泡減小，組織水腫消失，說明該方法能促進脊髓損傷后大鼠感覺和運動功能的恢復(fù)，但是其機制還需要進一步探討。

脊髓功能喪失主要是由繼發(fā)改變引起的，在損傷急性期通過減輕或消除繼發(fā)性病理變化、保護殘存的軸突和神經(jīng)元不再遭受二次損傷，是目前關(guān)于脊髓損傷治療研究的重點[11]。脊髓損傷主要是由于損傷后水腫的發(fā)生，激活一系列分子和細胞機制，引發(fā)炎癥反應(yīng)等，最終導(dǎo)致細胞的凋亡和壞死。運動神經(jīng)元細胞凋亡影響運動功能的恢復(fù)。有研究表明，Bcl-2、Bax 蛋白和Caspase-3 在脊髓損傷后神經(jīng)細胞的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[12]。Bcl-2 是凋亡抑制因子，能夠抑制或有效阻止脊髓損傷后各種途徑引起的細胞凋亡，促進受損神經(jīng)組織的修復(fù)。Bax 是凋亡促進因子，脊髓損傷后可刺激Bax 蛋白使線粒體膜的通透性發(fā)生變化，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。Caspase-3 是凋亡執(zhí)行因子，其表達水平可一定程度上反映細胞凋亡的情況。本研究結(jié)果表明，iPSCs-NSCs 組Bcl-2 陽性細胞表達明顯增加，Bax 陽性細胞和Caspase-3 mRNA 表達明顯減少，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs干預(yù)可使脊髓損傷大鼠Bcl-2 表達上調(diào)，Bax 和Caspase-3 表達下調(diào)，因而有效抑制神經(jīng)細胞凋亡。

脊髓損傷后局部膠質(zhì)瘢痕形成，上下行神經(jīng)傳導(dǎo)束中斷，微環(huán)境受損及神經(jīng)元細胞凋亡、壞死造成脊髓不可逆性恢復(fù)，本研究中采用3D 打印支架替換受損脊髓，不僅為中斷的神經(jīng)環(huán)路提供了“橋梁”，而且3D 打印支架是中空多孔的結(jié)構(gòu)，為上下行傳導(dǎo)束重建和軸突生長提供通道并除去物理隔離，對改善其物理微環(huán)境有著積極的作用。NSCs 是一種多能干細胞，有永久的增殖能力及分化多向性，可改善受損神經(jīng)元細胞，是理想的種子細胞。NSCs 移植能夠抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善受損神經(jīng)元神經(jīng)功能缺失[13-14]。本文采用人尿液細胞提取、分化成NSCs，不僅無創(chuàng)，費用低，且有效避免了倫理學(xué)的限制。

綜上所述，3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 可明顯恢復(fù)脊髓損傷大鼠運動功能，其原因可能為3D 打印支架為中斷的神經(jīng)環(huán)路提供了“橋梁”，NSCs 改善了受損脊髓微環(huán)境，其具體機制可能與上調(diào)Bcl-2表達及下調(diào)Bax、Caspase-3 表達，從而降低脊髓神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)。