生物信息學(xué)分析胰腺癌組織關(guān)鍵基因表達(dá)及其意義

王乾合 趙立然 朱克祥

胰腺癌(pancreatic carcinoma)是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，在惡性腫瘤中是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第3大原因。此外，胰腺癌的發(fā)生率正在逐年上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)2019年在美國(guó)因胰腺癌而死亡人數(shù)為45750例[1]。歐盟癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，胰腺癌在所有惡性腫瘤的發(fā)生率中排名第7位，病死率排名第4位，發(fā)生率與病死率大致相同，5年生存率不足8%[2]。胰腺癌早期患者通常無(wú)明顯癥狀，這一特征對(duì)胰腺癌的早期診斷造成了一定程度的困難。據(jù)統(tǒng)計(jì)只有約10%的胰腺癌患者能夠接受手術(shù)治療，但是術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者5年生存率僅為25%。近年來(lái)胰腺癌的治療方案有了很大的改進(jìn)，但由于患者的個(gè)體差異，其預(yù)后的敏感度和特異性仍不盡如人意。糖類抗原19-9(CA19-9)是胰腺腺癌臨床診斷和監(jiān)測(cè)治療中最常用和最有效的血清腫瘤標(biāo)志物。其診斷胰腺癌的特異性和敏感度分別為46%～98%和69%～93%[3]。因此，研究胰腺癌的病理機(jī)制，尋找早期檢測(cè)標(biāo)志物，提高胰腺癌患者的生存時(shí)間和預(yù)后迫在眉睫。

生物信息學(xué)作為一門新的學(xué)科，它是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，在獲得蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息后進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬和預(yù)測(cè)，然后依據(jù)特定蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行必要的藥物設(shè)計(jì)。本研究結(jié)合人類腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選差異基因并進(jìn)行深入分析，為胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)來(lái)源：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)獲取胰腺癌的表達(dá)譜芯片(GSE62452)，該數(shù)據(jù)集為全基因組mRNA表達(dá)芯片，其包含69例癌組織樣本，61例癌旁組織樣本。

2.數(shù)據(jù)處理：使用GEOquery包從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取胰腺癌相關(guān)芯片數(shù)據(jù)(GSE62452)，利用Limma包進(jìn)行差異分析，差異基因閾值設(shè)為| log(fold change)|>1且P<0.01。

3.差異基因的富集分析：使用R語(yǔ)言的clustreProfiler包對(duì)上調(diào)基因和下調(diào)基因進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)、GO(gene ontology)富集分析，以P<0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

4.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析：將差異基因?qū)隨TRING(https：∥stringdb.org/)在線分析網(wǎng)站構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，以combined score≥0.4為納入標(biāo)準(zhǔn)。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，并進(jìn)一步篩選關(guān)鍵基因。

5.關(guān)鍵基因生存分析：使用GEPIA(http：∥gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胰腺癌的關(guān)鍵基因在胰腺癌和正常組織中的表達(dá)進(jìn)行再次驗(yàn)證，繪制Kaplan-Meier生存曲線探索關(guān)鍵基因表達(dá)高低與預(yù)后的關(guān)系。

結(jié) 果

1.差異基因篩選結(jié)果：通過(guò)對(duì)基因芯片GSE62452分析，以| log(fold change)|>1且P<0.01為標(biāo)準(zhǔn)共得到286個(gè)顯著差異基因，包含上調(diào)基因189個(gè)，下調(diào)基因97個(gè)。使用Volcano Plot包繪制火山圖(圖1)。

圖1 差異基因火山圖

2.差異基因富集分析：對(duì)上調(diào)和下調(diào)基因分別進(jìn)行GO、KEGG分析, GO分析表明上調(diào)基因生物進(jìn)程涉及細(xì)胞組織黏附、細(xì)胞外基質(zhì)組織構(gòu)成等功能，下調(diào)基因與脂類消化、細(xì)胞壁破裂等功能密切相關(guān)(表1)。

表1 胰腺癌組織差異基因GO富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要涉及蛋白消化與吸收、PI3K-Akt等信號(hào)通路(圖3)，下調(diào)基因主要與胰腺分泌等信號(hào)通路密切相關(guān)(圖4、表2)。ECM-受體相互作用和胰腺分泌分別是上調(diào)基因和下調(diào)基因富集的主要通路(圖5、圖6)。

圖5 上調(diào)基因KEGG分析結(jié)果

圖6 下調(diào)基因KEGG分析結(jié)果

表2 胰腺癌組織差異基因KEGG富集分析結(jié)果

圖3 上調(diào)基因GO分析結(jié)果

圖4 下調(diào)基因GO分析結(jié)果

3.構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)：將差異基因?qū)隨TRING在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件篩選關(guān)鍵基因，最終得到20個(gè)關(guān)鍵基因(ITGB4、PLA2G1B、CTRC、CPB1、SYCN、ITGA2、ALB、CELA3B、PLAU、MMP11、LAMB3、PNLIP、CLPS、CPA1、ITGB6、PRSS3P2、LAMC2、LAMC3、MMP7、CPA2)。這些核心基因相互關(guān)聯(lián)，可能在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用(圖7)。富集分析結(jié)果表明，20個(gè)核心基因主要涉及ECM-受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路等。

圖7 20個(gè)關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

4.生存分析及核心基因驗(yàn)證：利用GPEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)20個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。生存分析顯示，MMP11、LAMB3以及PLAU與胰腺癌預(yù)后密切相關(guān)(圖8)，在芯片數(shù)據(jù)GSE28735分析45例胰腺癌組織和配對(duì)的癌旁正常組織對(duì)核心基因進(jìn)行驗(yàn)證，在兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中，PLAU、MMP11及LAMB3在胰腺腫瘤組織中顯著上調(diào)(表3)。

表3 胰腺癌中PLAU、MMP11及LAMB3在兩個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)

圖8 生存曲線

討 論

在美國(guó)，胰腺癌是癌癥相關(guān)死亡的第4大原因，且發(fā)生率還在不斷上升,預(yù)計(jì)到2030年將成為第2大常見(jiàn)惡性腫瘤[4]。胰腺癌的危險(xiǎn)因素包含吸煙、家族史、慢性胰腺炎、年齡增長(zhǎng)、男性、糖尿病、肥胖、非O血型、葉酸飲食以及幽門螺桿菌感染和牙周疾病[5]。近年來(lái)胰腺癌的診斷取得了一定程度的進(jìn)步，超聲內(nèi)鏡造影(CE-EUS)、EUS彈性成像或EUS引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢腫塊均有助于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌，尤其是對(duì)于影像學(xué)無(wú)法識(shí)別的無(wú)癥狀胰腺腫塊[6]。到目前為止，還沒(méi)有針對(duì)胰腺癌的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。對(duì)于這種致命疾病的早期診斷，仍然需要新的、更敏感的生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)胰腺癌GSE62452芯片進(jìn)行分析，共獲得286個(gè)差異基因，其中包含上調(diào)基因189個(gè)，下調(diào)基因97個(gè)。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示上調(diào)基因涉及細(xì)胞組織黏附、細(xì)胞外基質(zhì)組織構(gòu)成等功能以及蛋白消化與吸收、PI3K-Akt等信號(hào)通路相關(guān)。下調(diào)基因與脂類消化、細(xì)胞壁破裂等功能和胰腺分泌等信號(hào)通路密切相關(guān)。通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出20個(gè)關(guān)鍵基因，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析驗(yàn)證，顯示基因MMP11、LAMB3及PLAU可能與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

纖溶酶原激活物尿激酶(PLAU)是一種絲氨酸蛋白酶，主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，在炎癥與癌癥進(jìn)程中均發(fā)揮著重要作用，例如，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、黏附，同樣也參與肝臟、肌肉以及軸突再生。PLAU結(jié)合其受體PLAUR啟動(dòng)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。PLAU參與多種癌癥中的發(fā)展，例如胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌。PLAU的活性也是乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌預(yù)后和預(yù)測(cè)因素的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。研究結(jié)果顯示，胰腺癌中PLAU表達(dá)明顯上調(diào)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)PLAU在胰腺癌中明顯上調(diào)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致，但有關(guān)PLAU在胰腺癌中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證尚未見(jiàn)報(bào)道，需要開(kāi)展進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

基質(zhì)金屬蛋白酶-11(matrix metalloproteinase, MMP11)是MMP家族的一種蛋白水解酶，基質(zhì)蛋白(MMPs)是一種鋅依賴性的內(nèi)肽酶家族，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和組織重塑。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了24種哺乳動(dòng)物基質(zhì)金屬蛋白酶，這些酶參與胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、細(xì)胞凋亡、排卵、神經(jīng)生長(zhǎng)等生理過(guò)程。其活性受天然組織特異性抑制劑蛋白(TIMPS)的控制, MMPs與TIMPS的失衡與癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MMPs同樣在骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、牙周病、肺氣腫、皮膚潰瘍、動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演著不可或缺的角色。研究證實(shí)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的外泌體miRNA-139通過(guò)抑制MMP11表達(dá)抑制胃癌的進(jìn)展[9]。Eiro等[10]研究246例女性浸潤(rùn)性乳腺癌患者顯示，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)的MMP11是預(yù)測(cè)乳腺癌總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期最有效的獨(dú)立因素。Lee等[11]通過(guò)生物信息學(xué)分析得出MMP11可作為胰腺癌患者預(yù)后標(biāo)志物。

層粘連蛋白亞基β3(LAMB3)是編碼組成 LM-332的三聚體蛋白之一，由角質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是基底層重要的生物活性成分，影響著細(xì)胞分化、遷移和黏附以及細(xì)胞增殖和存活[12]。LM-332的α3、β3和γ2鏈分別由3個(gè)不同的基因LAMA3、LAMB3和LAMC2編碼。LAMB3對(duì)于結(jié)腸、胰腺、肺、宮頸和前列腺中腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力是不可或缺的[13]。在甲狀腺乳頭狀癌中，LAMB3通過(guò)調(diào)節(jié)c-MET/Akt信號(hào)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移瘤行為[12]。Kita等[14]研究表明LAMB3能夠作為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。有研究表明，LAMB3可作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，LAMB3沉默可增強(qiáng)順鉑等抗癌藥物的敏感度[15]。在胰腺癌中，Zhang等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明LAMB3可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌腺癌的細(xì)胞周期停滯和凋亡，并改變PDAC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移行為。Huang等[17]通過(guò)使用皮下異種移植腫瘤模型證明miR-24-3p/LAMB3軸在胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，并表明miR-24-3p/LAMB3軸可能代表了胰腺導(dǎo)管腺癌新型治療靶點(diǎn)。此外有研究證明，LAMB3可作為胰腺導(dǎo)管腺癌的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[18]。

對(duì)差異基因進(jìn)行功能與通路富集分析結(jié)果表明，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、胰腺分泌、蛋白消化與吸收等信號(hào)通路與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有著密切的聯(lián)系。黏著斑激酶(FAK)是一種胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，在多種實(shí)體癌中過(guò)表達(dá)和激活。FAK通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境中的癌細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)信號(hào)通路可能是參與FAK乳腺癌進(jìn)展的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一[20]。黏著斑激酶表達(dá)強(qiáng)度與胃癌患者的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移程度相關(guān)。文獻(xiàn)結(jié)果顯示，MMP11通過(guò)黏著斑激酶/Src激酶(FAK/Src)途徑增加了口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[21]。抑制LAMB3能夠激活FAK信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)[22]。然后，PLAU與FAK間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，仍需開(kāi)展深入研究。