煙曲霉菌損傷鼻上皮功能致慢性鼻竇炎的研究

張欠欠 張 玲 李志鵬 唐 如 張維天 葉海波

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是一種病程超過12周的鼻竇黏膜慢性炎癥性疾病[1]。在中國，其發(fā)生率高達8%。主要表現(xiàn)為鼻塞、黏膿性鼻涕、頭面部脹痛及嗅覺減退或喪失。CRS是一種高度異質性疾病，病因復雜，目前主要歸為3類，即上皮屏障功能受損、病原菌侵襲作用及宿主免疫系統(tǒng)的失衡[2]。鼻黏膜上皮作為病原體入侵鼻腔的第一道防線，在先天免疫和適應性免疫中都起著至關重要的作用，對維持鼻腔和鼻竇的健康具有重要意義。上皮屏障功能的維持主要依靠纖毛柱狀上皮細胞的清除、分泌功能及各種胞間連接，如緊密連接(tight junctions)、黏附連接(adherent junction)、橋粒(desmosome)、縫隙鏈接(gap junction)及連接黏附分子(junctional adhesion molecules)等[3]。其中緊密連接蛋白位于胞間連接蛋白的最頂端，充當“守門員”角色阻止外來抗原入侵。一旦緊密連接蛋白遭到破壞，體外的微生物、過敏原及毒素等可以跨越上皮細胞侵入黏膜下層，導致疾病發(fā)生。研究表明，CRS、過敏性鼻炎、哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等發(fā)病均與上皮屏障功能受損有關[4,5]。

真菌是CRS的致病因素之一，鼻竇炎患者竇腔壞死組織中常有真菌存在，如曲霉菌、毛霉菌、鏈格孢屬真菌及申克孢子絲菌等，其中以煙曲霉菌最為常見，與CRS的發(fā)病息息相關[6]。煙曲霉菌是一種植物腐生性真菌，廣泛分布于空氣、土壤及腐敗植物中，通常不在人類呼吸道定植[7]。免疫功能受損的個體一旦感染煙曲霉菌，其細胞壁某些成分可以促使炎性粒細胞遷徙至感染病灶，引發(fā)炎性反應[8]。據此，本研究使用煙曲霉菌提取物建立慢性鼻竇炎的小鼠模型，并推測煙曲霉菌可能通過破壞上皮屏障功能致鼻竇炎癥改變。

材料與方法

1.研究對象:20只小鼠隨機分為兩組，每組10只。對照組腹腔注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)與明礬的混合液200μl，鼻竇炎組等量腹腔注射煙曲霉菌提取物與明礬混合液以致敏。1周后，對照組每只小鼠每側鼻孔每次滴入無菌PBS 10μl，3次/周，持續(xù)1個月；鼻竇炎組每只小鼠等量滴入20000PNU/ml 煙曲霉菌提取液，3次/周，持續(xù)1個月。

2.組織病理學研究:所有實驗小鼠于第6周處死，按文獻[9]中方法，于T2及T3層面取小鼠鼻竇組織脫鈣及固定2周。石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)評估組織炎性反應狀態(tài)、阿利新藍-過碘酸雪夫(alcian blue and periodic acid-schiff staining，AB-PAS)染色評估杯狀細胞變化、甲苯胺藍(toluidine blue dyeing，TB)染色評估肥大細胞改變。

3.緊密連接蛋白的免疫組化評估：免疫組化染色(immunohistochemistry，IHC)評估煙曲霉菌提取物對小鼠鼻上皮緊密連接蛋白，如occludin、claudin-1及ZO-1表達的影響。

結 果

1.慢性鼻竇炎小鼠模型的建立：(1)HE染色：無論是在鼻底、鼻中隔及篩竇等鼻腔呼吸區(qū)或嗅區(qū)的黏膜部位，鼻竇炎組與對照組比較，可見纖毛柱狀上皮結構紊亂呈波浪狀改變，杯狀細胞增生，黏膜下組織腫脹，伴有炎性粒細胞浸潤和腺體增殖(圖1)。此外，在鼻竇炎組小鼠鼻竇組織中觀察到類似“息肉前改變”的上皮突起，在鼻腔中觀察到類似“夏科-雷登結晶(charcot leyden crystals)”樣分泌物(圖2)。(2)AB-PAS染色：鼻竇炎組竇腔黏液分泌較對照組明顯增多。杯狀細胞未見顯著增生；鼻竇炎組支氣管上皮細胞AB-PAS染色結果顯示杯狀細胞明顯增生(圖3)。(3)TB染色：鼻竇炎組肥大細胞數(shù)量較對照組明顯增加(圖4)。

圖1 小鼠鼻竇組織HE染色結果(×40)

圖2 鼻竇炎組小鼠竇腔炎癥改變

圖3 小鼠鼻上皮及支氣管上皮AB-PAS染色(×40)

圖4 小鼠鼻上皮TB染色(×40)

2.煙曲霉菌提取物破壞鼻黏膜上皮緊密連接蛋白：IHC染色結果顯示，緊密連接蛋白如occludin、claudin-1及ZO-1在鼻竇炎組小鼠鼻上皮表達量顯著下降(圖5)。

圖5 小鼠鼻上皮緊密連接蛋白IHC染色(×200)

討 論

本研究通過腹腔致敏及鼻腔滴注煙曲霉菌提取物的方法成功建立了小鼠CRS模型。組織病理學結果顯示，CRS小鼠鼻腔黏膜增生肥厚，伴有上皮細胞形態(tài)改變(細胞排列無序、纖毛柱狀上皮大小形態(tài)改變、杯狀細胞增生、腺體增殖等)及黏膜下炎性細胞的浸潤。此外，還觀察到CRS小鼠鼻腔黏膜上皮緊密連接蛋白表達減少，這可能是煙曲霉菌提取物通過損傷鼻上皮屏障功能導致CRS發(fā)生的原因之一，“夏科-雷登結晶”樣分泌物和類似“息肉前改變”的上皮突起提示煙曲霉菌可能進一步誘導了鼻息肉。

CRS模型動物有羊、兔、大鼠及小鼠等，其中小鼠由于操作簡單，易于獲得基因敲除表型等而獲得廣泛應用。但目前尚無成熟穩(wěn)定的CRS模型，對小鼠模型成功的標準也尚未統(tǒng)一，這可能與CRS的不同分型及不同品種小鼠的遺傳背景不同等相關。有關兔CRS模型成功的判斷標準較統(tǒng)一，即鼻竇黏膜增生肥厚伴有大量炎性細胞浸潤[10, 11]。參照兔CRS模型成功的標準，筆者的模型里出現(xiàn)了鼻竇黏膜增生肥厚、黏膜下腺體增生、上皮細胞形態(tài)改變及中性粒細胞浸潤等較明顯的系列鼻竇炎癥改變，與臨床上CRS患者的組織改變較一致。

Lindsay等[12]于2006年采用腹腔致敏及鼻腔滴注煙曲霉菌菌絲提取物的方式，建立了CRS的小鼠模型。由于本研究所使用的煙曲霉菌提取物成分和劑量與Lindsay等[12]不同，因此也有一些不同的研究發(fā)現(xiàn),在鼻竇炎組小鼠上皮細胞層檢測到了明顯的肥大細胞增生，但并未觀察到明顯的嗜酸性粒細胞浸潤。此外，可見纖毛柱狀上皮結構紊亂呈波浪狀改變，杯狀細胞增生，黏膜下組織腫脹，伴有炎性粒細胞浸潤(中性粒細胞為主)和腺體增殖。既往文獻報道表明，煙曲霉菌細胞壁的蛋白質成分可促進中性粒細胞趨化至真菌感染部位，而細胞壁的殼多糖則與嗜酸性粒細胞的趨化及機體的2型炎性反應有關[8, 13]。而本研究選擇的煙曲霉菌提取物中含量更多的是真菌細胞壁蛋白質成分，僅有少量的殼多糖，因此本研究的組織切片中并未見到明顯的嗜酸性粒細胞浸潤。當然這也可能與小鼠鼻腔正常定植菌群與造模用真菌的混合感染或是筆者選擇的組織切片部位較局限有關。

本研究在鼻竇炎組小鼠支氣管上皮層檢測到了明顯的杯狀細胞增生，但在鼻腔上皮層只檢測到了黏液分泌的增加，未見杯狀細胞顯著性改變。這可能是因為煙曲霉菌提取物破壞了杯狀細胞并促進黏膜下腺體的增生，但具體原因尚不明確。另外，造模時出現(xiàn)下呼吸道感染這一點與人類鼻竇炎不同，但與人類比較，小鼠的呼吸道更短，造模時很難避免下呼吸道的炎性反應。本研究在小鼠鼻腔上皮檢測到了“息肉前改變”的黏膜突起或囊泡樣小體，文獻提示這可能是CRS的息肉樣變[12, 14]。由于本研究造模時間較短，所以并未見到真正的的“息肉樣變”，延長煙曲霉菌作用時間或增加藥物濃度或許可以見到較明顯的改變。在小鼠鼻腔鼻竇中發(fā)現(xiàn)了類似于“夏科-雷登結晶”的分泌物，這提示鼻上皮下有嗜酸性粒細胞的浸潤及Th2型炎性反應[15]。六胺銀真菌染色結果并未見到兩組有明顯區(qū)別，這可能是因為煙曲霉菌提取物的刺激時間或劑量沒有達到足以檢測的水平。綜合以上這些變化，小鼠鼻竇炎癥改變明顯，為后續(xù)研究奠定了基礎。

Ahn等[16]通過手術干預、鼻腔填塞及滴注鏈球菌的方法，致鼻竇黏膜中性粒細胞浸潤、上皮增厚、杯狀細胞增生、黏膜下纖維增生及上皮結構紊亂等改變，建立了CRS模型。但手術干預直接損傷鼻竇的的方式并不符合人類CRS的發(fā)病過程。本研究采用腹腔致敏及鼻腔滴注煙曲霉菌的方式建立了CRS的小鼠模型更好地模擬了人類變應性真菌性鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展過程。緊密連接蛋白的免疫組化染色結果顯示，與對照組比較，鼻竇炎組緊密連接蛋白如occludin、claudin-1、ZO-1等明顯減少。真菌在鼻竇炎發(fā)病過程中的作用至今尚不十分明確，既往研究認為Th2型鼻竇炎性反應是真菌侵襲的結果，但隨后許多研究并不支持這一觀點[17]。

本研究結果表明，煙曲霉菌提取物可能通過破壞上皮屏障功能致鼻竇系列炎性反應。既往研究并未發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌對鼻上皮緊密連接蛋白的破壞作用，且對煙曲霉菌致鼻竇炎的機制目前尚不明確，所以本研究對于探討煙曲霉菌的致病作用具有重要意義。需要注意的是，上皮屏障功能的破壞涉及多個復雜機制，與上皮間質轉化密不可分。臨床研究證實，鼻腔鼻竇黏膜改變的氣道上皮重塑是CRS特征之一[18]。研究表明，上皮間質轉化的上皮細胞胞內骨架蛋白的結構改變使上皮細胞失去極性，胞間連接蛋白減少及波形蛋白產生增加[19]。表達波形蛋白的鼻上皮細胞可能與黏膜增厚及嗜酸性粒細胞浸潤相關。因此，煙曲霉菌提取物與上皮間質轉化的關系，以及煙曲霉菌提取物對上皮細胞形態(tài)和胞間連接蛋白等的影響有待未來進一步探究。

盡管本研究建立了慢性鼻竇炎的小鼠模型，但由于小鼠鼻腔鼻竇解剖與人類有較大不同，如不具有蝶竇及額竇的結構、鼻腔由大面積的嗅上皮覆蓋及鼻甲結構比人類復雜等使得模型不能很好地模擬人類鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展[20]。其次，尚且缺乏對煙曲霉菌致鼻上皮緊密連接蛋白減少的機制研究，尚不明確緊密連接蛋白表達上調對CRS疾病緩解的作用。后續(xù)需通過增加體外細胞實驗及分子生物學實驗才可以對該現(xiàn)象及假設進行進一步驗證。

綜上所述，本研究通過建立CRS的BALB/c小鼠模型，闡述了鼻上皮間緊密連接蛋白的破壞在煙曲霉菌提取物致小鼠鼻竇炎發(fā)生中的作用。但分子作用機制目前尚不十分明確，仍需增加體外實驗進行深入探討。