長(zhǎng)度和化學(xué)修飾在多壁碳納米管誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化中的作用

申 杰，楊 迪，陳夢(mèng)圓，郭新彪

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)是MWCNTs進(jìn)入血液輸送至靶器官之前需要接觸的細(xì)胞[6]。生理?xiàng)l件下，ECs參與調(diào)節(jié)代謝平衡、血管血流動(dòng)力學(xué)、血管通透性、凝血和細(xì)胞募集。內(nèi)皮細(xì)胞活化是指內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)環(huán)境刺激發(fā)生的細(xì)胞表型或功能的改變，最顯著的特征是內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞相互作用的增加，該活化過(guò)程還包括趨化因子和細(xì)胞表面黏附因子的表達(dá)上調(diào)[7]。內(nèi)皮細(xì)胞活化在缺血再灌注損傷、血栓形成以及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。探討MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的作用規(guī)律及其機(jī)制，評(píng)估MWCNTs暴露對(duì)ECs的毒性以及改善MWCNTs的生物相容性有重要意義。

炎性小體是胞漿中激活半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate-specific proteases caspase)-1的多聚蛋白復(fù)合物,核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小體是目前研究最深入和最具特征的炎性小體[9]，它可識(shí)別多種病原信號(hào)并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。動(dòng)物和體外實(shí)驗(yàn)表明，NLRP3炎性小體的激活參與內(nèi)皮細(xì)胞活化[10-11],然而現(xiàn)有研究尚缺少M(fèi)WCNTs激活ECs內(nèi)NLRP3炎性小體的相關(guān)證據(jù)，不同長(zhǎng)度和化學(xué)修飾的MWCNTs對(duì)ECs內(nèi)NLRP3炎性小體的激活作用也尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在比較不同長(zhǎng)度和化學(xué)修飾的MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的作用并探討NLRP3炎性小體相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

杜氏培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、RPMI 1640 培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞增殖檢測(cè)(cell counting kit，CCK)-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，小鼠血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，活細(xì)胞示蹤劑 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，GAPDH抗體、NLRP3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，磷酸化蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 MWCNTs的理化表征及染毒液制備

研究使用的MWCNTs分別為未修飾的短MWCNT(short MWCNT，S-MWCNT)、未修飾的長(zhǎng)MWCNT(long MWCNT，L-MWCNT)、羧基修飾的長(zhǎng)MWCNT(long carboxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNTs-COOH)、羥基修飾的長(zhǎng)MWCNT(long hydroxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNT-OH)和氨基修飾的長(zhǎng)MWCNT(long amino-functionalized MWCNT，L-MWCNT-NH2)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，采用化學(xué)氣相沉積法(chemical vapor deposition，CVD)合成。產(chǎn)品說(shuō)明中MWCNTs的基本特征信息見(jiàn)表1。

表1 廠家提供的MWCNTs理化性質(zhì)信息Table 1 The physicochemical information of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) provided by the manufacturer

為進(jìn)一步表征MWCNTs，前期研究采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM，JEM-1400 Plus，日本JEOL公司)對(duì)MWCNTs的形態(tài)和粒徑進(jìn)行觀察，具體方法和結(jié)果參考本課題組前期研究[12-13]。本研究應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(dynamic light scattering and Zetasizer，Zetasizer nano ZS，英國(guó)Malvern公司)對(duì)MWCNTs在DMEM(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% FBS)培養(yǎng)液中的分散狀態(tài)、平均水化粒徑及Zeta電位進(jìn)行表征。

將MWCNTs粉末以1 g/L的濃度分散在含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的PBS溶液中，在冰水中超聲分散3 h得到儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。每次使用前，將?chǔ)備液超聲處理5 min，然后在含有2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) FBS的培養(yǎng)液中稀釋至最終染毒濃度。

1.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株b.End3和人外周血單核細(xì)胞株THP-1培養(yǎng)

本研究使用的細(xì)胞模型為小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞株b.End3和人外周血單核細(xì)胞株THP-1，均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。b.End3是目前常用的永生化血管內(nèi)皮細(xì)胞系之一，具有純度高、易獲取、易操作、各代細(xì)胞間變異小等優(yōu)點(diǎn)[14]。該細(xì)胞系在活化狀態(tài)下表達(dá)較豐富的黏附因子和選擇素，常用于內(nèi)皮細(xì)胞活化的相關(guān)研究[15]。b.End3細(xì)胞在含有10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、飽和濕度、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定在 3～20代細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

人外周血單核細(xì)胞系THP-1在含有10% FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1% 青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)測(cè)定在3～20代細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

第四，要錘煉高尚的品格和堅(jiān)韌不拔的耐力。一個(gè)國(guó)家、一個(gè)民族，沒(méi)有一種精神力量，就形不成很強(qiáng)的凝聚力。習(xí)近平總書(shū)記說(shuō)：“中華民族偉大復(fù)興，絕不是輕輕松松、敲鑼打鼓就能實(shí)現(xiàn)的。全黨必須準(zhǔn)備付出更為艱巨、更為艱苦的努力?！敝腥A民族的復(fù)興，是一個(gè)很長(zhǎng)的過(guò)程，要注重培養(yǎng)一種積極的生活態(tài)度，展示良好的精神風(fēng)貌，使平凡者變得偉大，平庸者擺脫平庸。古往今來(lái)，無(wú)數(shù)商業(yè)巨子、政壇領(lǐng)袖、文學(xué)大師，都是飽經(jīng)風(fēng)雨，以頑強(qiáng)的毅力，在風(fēng)浪中搏擊。我們要敢于直面困難、直面挑戰(zhàn)、堅(jiān)韌不拔、百折不撓，一步一個(gè)腳印，全力寫(xiě)好人生的答卷。

1.4 細(xì)胞毒性測(cè)定

采用CCK-8和LDH釋放試劑盒測(cè)定細(xì)胞毒性，b.End3細(xì)胞暴露于不同濃度的MWCNTs(0～125 μg/cm2)24 h后，進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，細(xì)胞上清液15 000 ×g，離心30 min后用于LDH釋放測(cè)定。使用多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)在450 nm(用于CCK-8)或490 nm(用于LDH釋放試驗(yàn))測(cè)定光密度。

1.5 ELISA測(cè)定細(xì)胞上清中可溶性VCAM-1含量

使用小鼠VCAM-1酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定MWCNTs染毒后的細(xì)胞上清中可溶性VCAM-1(soluble VCAM-1，sVCAM-1)含量，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定的D值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣本D值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.6 單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)

通過(guò)活細(xì)胞示蹤劑 CMFDA(cell tracker green 5-chloromethylfluorescein diacetate)標(biāo)記THP-1單核細(xì)胞，并將標(biāo)記好的THP-1與暴露MWCNTs后的b.End3在正常生長(zhǎng)條件下孵育1 h，孵育完畢，使用PBS沖洗b.End3細(xì)胞3次，將未黏附在b.End3細(xì)胞上的THP-1去除。采用倒置熒光顯微鏡觀察黏附在b.End3細(xì)胞上的THP-1(綠色熒光標(biāo)記)，每組選取10個(gè)視野拍攝并保存圖片，使用Image J軟件計(jì)算每張圖片中熒光THP-1細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.7 Western blot

b.End3細(xì)胞暴露于6.25 μg/cm2的MWCNTs不同時(shí)間(4、12和24 h)后，使用磷酸化蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì),使用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法對(duì)提取蛋白定量。以50 μg蛋白/槽上樣至10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，40 mA恒流電泳1.5 h；然后250 mA 2.5 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜在含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的TBST中室溫封閉2 h后，4 ℃孵育一抗(NLRP3抗體)1∶300、GAPDH抗體(內(nèi)參)1∶1 000過(guò)夜。然后與山羊抗兔或山羊抗鼠-HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)檢測(cè)蛋白條帶并拍照，使用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Graphpad prism7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。采用Studentt檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較，單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較；若有差異，則采用Turkey’s檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MWCNTs的理化表征

根據(jù)廠家提供的信息(表1)，所有類型碳管的純度均>98%，且具有相似的外徑。使用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)分散在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(含2%FBS)中的MWCNTs進(jìn)行了表征，MWCNTs的平均水化粒徑為80～250 nm(表2)，多分散系數(shù)(polydispersity，PDI)為0.248～0.310，各組的Zeta電位均為負(fù)，且絕對(duì)值相差不大，均在10左右，提示各組碳管在培養(yǎng)液中分散狀況均良好。

表2 MWCNTs的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical characterization of the multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)

2.2 MWCNTs對(duì)b.End3的細(xì)胞毒性

采用CCK-8和LDH測(cè)定MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞b.End3增殖活性和細(xì)胞膜完整性的影響，為后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定提供劑量設(shè)置依據(jù)。隨著染毒劑量的增加，所有類型的MWCNTs均會(huì)引起b.End3的細(xì)胞活性降低，細(xì)胞膜完整性受損，LDH釋放增加(圖1)。在125 μg/cm2的濃度下，所有類型的MWCNTs作用24 h后均誘導(dǎo)b.End3細(xì)胞活性顯著降低，LDH釋放顯著增加，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。在較高濃度62.5 μg/cm2下，亦可觀察到部分碳納米管對(duì)b.End3細(xì)胞活性和LDH釋放的影響。相同濃度下，未觀察到各MWCNTs處理組對(duì)細(xì)胞增殖活性影響的顯著差異。在125 μg/cm2的濃度下，L-MWCNT作用后的細(xì)胞LDH釋放顯著高于S-MWCNT組(P<0.01)，也高于L-MWCNT-COOH、L-MWCNT-OH和L-MWCNT-NH2處理組(P<0.01)；在62.5 μg/cm2的濃度下，S-MWCNT作用后的細(xì)胞LDH釋放顯著低于L-MWCNT處理組(P<0.01)。

Cells were treated with different concentrations of MWCNTs for 24 h,and cell proliferation rate and cell membrane damage were detected by CCK-8 (A) and LDH (B) release assay,respectively.*P<0.05 or △P<0.01 vs. controls.#P<0.05 or ▲P<0.01 vs. L-MWCNT group.圖1 MWCNTs對(duì)b.End3的細(xì)胞毒性Figure 1 Cytotoxicity of MWCNTs in b.End3 cells

2.3 不同長(zhǎng)度的MWCNTs對(duì)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)的影響

采用ELISA測(cè)定碳管染毒后的b.End3細(xì)胞上清sVCAM-1水平，并采用細(xì)胞黏附試驗(yàn)檢測(cè)b.End3對(duì)單核細(xì)胞THP-1的黏附力，共同評(píng)價(jià)MWCNTs對(duì)b.End3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響(圖2)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的濃度下，兩種長(zhǎng)度MWCNTs作用b.End3細(xì)胞24 h后均誘導(dǎo)細(xì)胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對(duì)THP-1的黏附力顯著增強(qiáng)(P<0.05和P<0.01)。在相同濃度下，L-MWCNT處理組的細(xì)胞上清sVCAM-1水平及細(xì)胞對(duì)THP-1的黏附力顯著強(qiáng)于S-MWCNT處理組(P<0.05，P<0.01)。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of S-MWCNT and L-MWCNT on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05,▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.圖2 不同長(zhǎng)度MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)比較Figure 2 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different lengths

2.4 不同化學(xué)修飾的MWCNTs對(duì)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)的影響

比較相同長(zhǎng)度下未修飾，羧基、氨基和羥基修飾的MWCNTs對(duì)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響(圖3)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的濃度下，所有類型的MWCNTs作用b.End3細(xì)胞24 h后均誘導(dǎo)細(xì)胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對(duì)THP-1的黏附力顯著增強(qiáng)(P<0.01)。而在相同濃度下，不同化學(xué)修飾的MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).△P<0.01 vs.untreated controls.圖3 不同化學(xué)修飾的MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)比較Figure 3 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different chemical modification

2.5 不同長(zhǎng)度和化學(xué)修飾的MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化的時(shí)效關(guān)系

探討MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化的時(shí)效關(guān)系(圖4A、4B)，6.25 μg/cm2的L-MWCNT和S-MWCNT作用12 h后，b.End3細(xì)胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對(duì)THP-1的黏附力顯著增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效應(yīng)更加明顯，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。作用24 h后，L-MWCNTs處理組細(xì)胞上清sVCAM-1水平顯著高于S-MWCNT處理組(P<0.05和P<0.01)；作用12 h后，L-MWCNTs處理組細(xì)胞對(duì)THP-1的黏附力顯著強(qiáng)于S-MWCNT處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

對(duì)于相同長(zhǎng)度下4種不同化學(xué)修飾的MWCNTs(圖4C、4D)，6.25 μg/cm2的MWCNTs作用12 h后，L-MWCNT、L-MWCNT-COOH和L-MWCNT-OH處理組細(xì)胞上清sVCAM-1含量顯著增加，4種MWCNTs誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì) THP-1的黏附力均顯著增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效應(yīng)更加明顯，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在相同的作用時(shí)間下，不同化學(xué)修飾的MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

After exposure to 6.25 μg/cm2 MWCNTs for 4 h,12 h or 24 h,time-dependent effects of S-MWCNTs and L-MWCNTs on the endothelial activation of b.End3 were determined (A,B).Similarly,time-dependent effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation were also evaluated (C,D).sVCAM-1,soluble vascular adhesion molecule-1.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.圖4 不同長(zhǎng)度或化學(xué)修飾的MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化的時(shí)效關(guān)系Figure 4 Time-dependent effects of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs with different length or chemical modification

2.6 MWCNTs的長(zhǎng)度和羧基修飾對(duì)b.End3細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)的影響

由于羧基、羥基或氨基修飾對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化未見(jiàn)明顯影響，因此,為進(jìn)一步探討MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化在長(zhǎng)度和修飾形式兩個(gè)方面產(chǎn)生效應(yīng)差異的可能機(jī)制，選取了S-MWCNT、L-MWCNT、L-MWCNT-COOH 3種碳管，在 6.25 μg/cm2濃度下作用b.End3細(xì)胞不同時(shí)間后，比較長(zhǎng)度和羧基修飾對(duì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3蛋白表達(dá)水平的影響(圖5)，3種MWCNTs作用后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3蛋白表達(dá)水平均表現(xiàn)為隨時(shí)間增加而增加的趨勢(shì)。作用24 h后，S-MWCNT誘導(dǎo)細(xì)胞NLRP3表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，而L-MWCNT和L-MWCNT-COOH處理組在作用4 h后觀察到細(xì)胞中NLRP3表達(dá)水平的顯著增加并持續(xù)至24 h(P<0.05，P<0.01)。作用4 h和12 h時(shí)，L-MWCNT處理組細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平顯著高于S-MWCNT處理組(P<0.05)，而L-MWCNT與L-MWCNT-COOH兩組間效應(yīng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Cells were treated with 6.25 μg/cm2 S-MWCNT,L-MWCNT or L-MWCNT-COOH for 4 h,12 h or 24 h,and the protein expression of NLRP3 were determined by western blot analysis.NLRP3,nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3;GADPH,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05 vs. S-MWCNT group.圖5 MWCNTs的長(zhǎng)度和羧基修飾對(duì)b.End3細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of length and carboxyl modification of MWCNTs on the expression of NLRP3 in b.End3 cells

3 討論

MWCNTs的生物學(xué)效應(yīng)與其理化特性(包括長(zhǎng)度、直徑、表面化學(xué)修飾等)有關(guān)[16-17]。現(xiàn)有研究中，用于構(gòu)建藥物載體的MWCNTs最長(zhǎng)可達(dá)30 μm[18]，最短為 0.3 μm[19]；羧基修飾可以改善MWCNTs的分散性和親水性，可作為鉑類藥物載體用于乳腺癌治療[20]；羥基修飾的MWCNTs參與構(gòu)建復(fù)合納米纖維可用于膠質(zhì)瘤治療[21]；氨基修飾的MWCNTs具有穿過(guò)血腦屏障向腦部運(yùn)輸藥物的可能[22]。本研究比較了長(zhǎng)(10～30 μm)和短(0.5～2.0 μm)兩種MWCNTs，以及未修飾與羧基、氨基、羥基4種常用化學(xué)修飾的MWCNTs。細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示，所有類型的MWCNTs在高劑量下均會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成明顯的毒性損傷，而長(zhǎng)度的縮短以及羧基、氨基或羥基修飾可以不同程度地減弱MWCNTs的細(xì)胞毒性。研究通過(guò)細(xì)胞毒性測(cè)定選取未對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成明顯毒性的低劑量(0～12.5 μg/cm2)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

MWCNTs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，主要表現(xiàn)為黏附分子的表達(dá)和分泌增加及對(duì)單核細(xì)胞的黏附力增強(qiáng)。Cao等[23]發(fā)現(xiàn)16～64 mg/L的MWCNTs作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)24 h，可誘導(dǎo)VCAM-1表達(dá)增加，并導(dǎo)致HUVEC對(duì)單核細(xì)胞的黏附增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)明顯細(xì)胞毒性的劑量下(≥6.25 μg/cm2)，所有類型的MWCNTs均可誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化，表現(xiàn)為VCAM-1分泌增加，THP-1黏附增加，且觀察到了明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，相同條件下，長(zhǎng)度改變對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化影響明顯，但相同長(zhǎng)度下，化學(xué)修飾對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)無(wú)明顯影響。既往的體外研究亦發(fā)現(xiàn)未修飾、羧基修飾和羥基修飾的MWCNTs均誘導(dǎo)HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞活化，但無(wú)明顯差異[24-25]，這提示在無(wú)明顯毒性劑量下，與化學(xué)修飾的改變相比，長(zhǎng)度的改變對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響可能更明顯。

有研究表明NLRP3炎性小體的激活是MWCNTs誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制[26-27]。體內(nèi)外的多項(xiàng)研究證實(shí)NLRP3炎性小體激活參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞活化[10-11]。然而，現(xiàn)有研究中缺乏MWCNTs激活內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3炎性小體的相關(guān)證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MWCNTs可以誘導(dǎo)b.End3細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)增加，在相同濃度下，長(zhǎng)MWCNTs誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)水平高于短MWCNTs，而未修飾和羧基修飾的MWCNTs之間無(wú)明顯差異，與MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的結(jié)果趨勢(shì)高度一致。時(shí)效關(guān)系結(jié)果顯示，MWCNTs對(duì)細(xì)胞NLRP3表達(dá)的影響出現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞活化之前，提示MWCNTs可能是通過(guò)激活NLRP3蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化；與化學(xué)修飾的改變相比，長(zhǎng)度的改變對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮效應(yīng)的影響更明顯，提示長(zhǎng)度可能是MWCNTs誘導(dǎo)NLRP3蛋白表達(dá)的重要因素。

綜上所述，本研究通過(guò)比較長(zhǎng)度和化學(xué)修飾在MWCNTs誘導(dǎo)b.End3內(nèi)皮細(xì)胞活化效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯毒性劑量下，與化學(xué)修飾的改變相比，長(zhǎng)度的改變對(duì)MWCNTs誘導(dǎo)內(nèi)皮效應(yīng)的影響更明顯。MWCNT通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3蛋白表達(dá)水平升高參與內(nèi)皮細(xì)胞活化,因此，MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響可能與NLRP3炎性小體的激活有關(guān)。在生物及醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用中，與化學(xué)修飾相比，改變MWCNTs的長(zhǎng)度也許對(duì)于改善其生物相容性更有意義，這有待進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。此外，鑒于在生物醫(yī)療領(lǐng)域相關(guān)的應(yīng)用中，MWCNTs有可能直接接觸血管內(nèi)皮細(xì)胞，其安全性評(píng)價(jià)中應(yīng)關(guān)注對(duì)血管內(nèi)皮的生物效應(yīng)。