池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

邱楚雯，袁新程，施永海，王韓信，謝永德，徐嘉波，稅春

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

目前，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展受到土地、水及環(huán)境問題的限制。為了促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展，需要最大限度地利用土地、水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而減少對(duì)環(huán)境的影響[1]。池塘魚菜立體種養(yǎng)模式是一種將水栽植物與傳統(tǒng)水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)相結(jié)合的綠色養(yǎng)殖模式。池塘魚菜立體種養(yǎng)模式使魚—蝦—菜間達(dá)到生態(tài)平衡關(guān)系，生產(chǎn)高品質(zhì)綠色的魚、蝦和蔬菜，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益雙贏，被認(rèn)為是未來水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的方向[2-3]。池塘魚菜立體種養(yǎng)模式以生態(tài)系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)為主導(dǎo)，通過水域中生物(動(dòng)物、植物、微生物)間和生物與環(huán)境間的相互作用形成生態(tài)系統(tǒng)的平衡，微生物在其中發(fā)揮著重要的作用。但自然界中的細(xì)菌可在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的較少，要反映環(huán)境中菌群的結(jié)構(gòu)組成不能僅僅依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法[4]。目前，對(duì)環(huán)境微生物的研究多采用新一代的高通量測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)能夠較準(zhǔn)確地定性和定量分析微生物的多樣性和豐度，有利于深入準(zhǔn)確了解魚菜立體種養(yǎng)模式下的微生物群落結(jié)構(gòu)[5-7]。

目前，針對(duì)暗紋東方鲀池塘立體種養(yǎng)模式下系統(tǒng)微生物多樣性的研究鮮有報(bào)道。本研究中的池塘魚菜立體種養(yǎng)模式，以暗紋東方鲀Takifuguobscures為主養(yǎng)品種，套養(yǎng)對(duì)蝦，同時(shí)在養(yǎng)殖水面上栽種蕹菜IpomoeaaquaticaForsk。該模式利用水培植物蕹菜吸收養(yǎng)分，提高水體利用率，減少污染物的排放；此外，暗紋東方鲀主要生活在水體的中下層，凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvanname主要生活在底層，這使得該系統(tǒng)形成了菜—鲀—蝦的上—中—下3層結(jié)構(gòu)，充分利用了水體空間。暗紋東方鲀屬兇猛肉食性魚類，會(huì)捕食凡納濱對(duì)蝦。凡納濱對(duì)蝦面對(duì)捕食會(huì)采取防御手段，包括潛底、隱蔽或連續(xù)彈跳，在這樣的生存環(huán)境下，體質(zhì)健壯的對(duì)蝦個(gè)體才能夠適應(yīng)并生存下來，而體弱及患病對(duì)蝦個(gè)體就會(huì)被暗紋東方鲀吞食而淘汰，從而達(dá)到生態(tài)防病的目的。由于暗紋東方鲀對(duì)水質(zhì)要求較高，殘餌等容易導(dǎo)致水質(zhì)變差，而凡納濱對(duì)蝦為底棲雜食性甲殼類動(dòng)物，在減少投喂蝦料的條件下可攝食暗紋東方鲀的剩料、有機(jī)碎屑及浮游動(dòng)植物，起到“清道夫”的作用，有效防止餌料腐敗變質(zhì)。本研究中，對(duì)池塘魚菜立體種養(yǎng)模式下的水體、底泥、蕹菜根際與根表、暗紋東方鲀與凡納濱對(duì)蝦腸道微生物的16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行了高通量測(cè)序，分析了系統(tǒng)不同組成的微生物群落結(jié)構(gòu)及差異，以期為池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)微生物的研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)(鲀—蝦—菜)養(yǎng)殖試驗(yàn)于2019年4月在上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地池塘進(jìn)行，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)池塘，每個(gè)池塘養(yǎng)殖面積為0.17 hm2。試驗(yàn)用暗紋東方鲀?cè)醋苑钯t科研基地，凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自海南如意來水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，蕹菜購(gòu)自上海玫瑰園商貿(mào)城。暗紋東方鲀放養(yǎng)規(guī)格約150 g，放養(yǎng)密度為1.194萬(wàn)尾/hm2，合計(jì)每個(gè)池塘投放2 000尾；凡納濱對(duì)蝦放養(yǎng)規(guī)格為0.6 ～1.0 cm，放養(yǎng)密度為253.9萬(wàn)尾/hm2，合計(jì)每個(gè)池塘投放2.85萬(wàn)尾；每個(gè)池塘蕹菜栽種量為12 kg，養(yǎng)殖周期為5個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 于養(yǎng)殖試驗(yàn)?zāi)┢?8—9月)分批采集試驗(yàn)樣品，采集3個(gè)魚菜立體種養(yǎng)池塘的水體(MW1～MW3)、底泥(MS1～MS3)、蕹菜根際(RM1～RM3)、蕹菜根表(MRS1～MRS3)、暗紋東方鲀腸道內(nèi)容物(MIP1～MIP3)和凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物(MIS1～MIS3)，共計(jì)18個(gè)樣品，具體采集方法如下。

水體與底泥：采樣時(shí)池塘水溫為(27±1)℃，pH為 8.14±0.17，水體和底泥樣品的采集采用5點(diǎn)采樣法。利用采水器采集離水面50 cm處的水樣200 mL，混合后用裝有0.22 μm微孔濾膜的真空抽濾裝置進(jìn)行抽濾，取出濾膜于滅菌離心管中，于-80 ℃下保存待測(cè)，即為水體樣品。利用柱狀采泥器采集1～5 cm的池塘表層底泥(100 mL)，混合后置于滅菌離心管中，于-80 ℃下保存待用，即為底泥樣品。

蕹菜根際及根表：將根系表面附著的大塊泥去掉后，加入無(wú)菌PBS緩沖液，反復(fù)洗滌并經(jīng)3 200×g離心15 min后，得到沉淀，即為根際樣品。將反復(fù)洗滌后的蕹菜根系浸沒于無(wú)菌PBS溶液中，以180 r/min孵育20 min，反復(fù)進(jìn)行4次后，匯總洗滌液，用裝有0.22 μm微孔濾膜的真空抽濾裝置進(jìn)行抽濾，收集濾膜于滅菌離心管中，-80 ℃下保存待測(cè)，即為根表樣品。

腸道內(nèi)容物：隨機(jī)從每個(gè)池塘中采集5尾暗紋東方鲀，魚體規(guī)格為(242.65±42.34)g，將暗紋東方鲀無(wú)菌解剖后取出整個(gè)腸道，將腸道內(nèi)容物擠出，使用少量PBS緩沖液沖洗腸道內(nèi)壁，收集腸道內(nèi)容物樣品于滅菌離心管中，并將5尾魚腸道內(nèi)容物混勻成一個(gè)樣品，即為鲀腸道內(nèi)容物樣品。隨機(jī)從每個(gè)池塘中采集10只凡納濱對(duì)蝦，蝦體規(guī)格為(20.04±3.62)g，將凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行無(wú)菌解剖后取出整個(gè)腸道，將腸道內(nèi)容物擠出，同一池塘10只蝦的腸道內(nèi)容物混均成一個(gè)樣品，即為蝦腸道內(nèi)容物樣品。

1.2.2 DNA 抽提和PCR擴(kuò)增 根據(jù)DNA提取試劑盒(FastDNA?SPIN Kit) (MP Biomedicals, U.S.)說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。用338F (5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和806R (5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′) 引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃下預(yù)變性180 s；95 ℃下循環(huán)變性30 s，55 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行27個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸 10 min。擴(kuò)增體系(共20 μL)：5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物338F、806R各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

1.2.3 Illumina MiSeq 測(cè)序 采用20 g/L瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，再用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒(Axygen) 進(jìn)行純化。采用QuantiFluorTM-ST (Promega) 進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將擴(kuò)增片段構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后，用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，并用FLASH軟件進(jìn)行拼接；采用UPARSE(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)97%相似度水平對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)在不同分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成；采用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)、ACE指數(shù))和群落多樣性指數(shù)(香農(nóng)指數(shù)Shannon、辛普森指數(shù)Simpson)。

采用T檢驗(yàn)法進(jìn)行樣本多樣性指數(shù)的顯著性差異分析(P<0.05)；利用R語(yǔ)言工具制作物種組成分析群落柱形圖和樣本比較分析的主坐標(biāo)分析(PCoA)圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因測(cè)序特點(diǎn)

6組18個(gè)樣本的平均序列數(shù)為66 390條，97%相似度水平下分類操作單元(operational taxonomic units, OTUs)數(shù)為9 082。從表1可見：池塘魚菜立體種養(yǎng)模式下不同樣本的OTU數(shù)為512～4 013；群落豐富度指數(shù)中，Chao1指數(shù)為761.71～5 474.29，ACE指數(shù)為986.94～5 687.55；群落多樣性指數(shù)中，Shannon指數(shù)為1.69～6.55，Simpson指數(shù)為 0.01～0.34；所有樣本的物種覆蓋率均大于96.05%。這表明，本次測(cè)序基本上代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

樣本中細(xì)菌的豐富度總體上排序?yàn)榈啄?蕹菜根際>蕹菜根表≈蝦腸道>水體>鲀腸道；樣本中細(xì)菌的多樣性排序?yàn)榈啄?蕹菜根際>蕹菜根表>水體>蝦腸道>鲀腸道；底泥中微生物的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)明顯大于其他組，而Simpson指數(shù)則小于其他組，暗紋東方鲀腸道中微生物的Chao1、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)最小，而Simpson指數(shù)則大于其他組(表1)。

表1 在97%相似度水平上樣品中細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)

2.2 微生物群落整體結(jié)構(gòu)

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)的6組樣品細(xì)菌分布于62個(gè)門，其中12個(gè)門的豐度大于1%，即變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、Epsilonbacteraeota、綠彎菌門Chloroflexi、軟壁菌門Tenericutes、螺旋體門Spirochaetes、疣微菌門Verrucomicrobia、酸桿菌門Acidobacteria和浮霉?fàn)罹TPlanctomycetes的占比分別為27.71%、16.37%、16.05%、10.07%、8.29%、5.30%、2.72%、2.52%、2.25%、2.04%、1.92%和1.25%，其他占3.50%。

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)的6組樣品細(xì)菌分布于1 503個(gè)屬，其中19個(gè)屬的豐度大于1%。在屬水平上，不同樣品組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌(豐度大于5%的菌屬)的組成及豐度存在明顯不同，主要優(yōu)勢(shì)菌屬紅球菌屬Rhodococcus、葡萄球菌屬Staphylococcus、弓形菌屬Arcobacter、norank_f_norank_o_Chloroplast、norank_f_Nostocaceae、紅桿菌屬Rhodobacter、HgcI_clade、短螺旋體菌屬Brevinema、蓋絲藻屬Geitlerinema_PCC-7105、CL500-29_marine_group、Elizabethkingia、norank_f_Steroidobacteracea、Candidatus_Bacilloplasma、擬浮絲藻屬Planktothricoides_SR001、浮絲藻屬Planktothrix_NIVA-CYA_15、支原體屬M(fèi)ycoplasma、norank_f_Saprospiraceae、Alkalinema_CENA528和unclassified_f_Burkholderiaceae占比分別為6.91%、5.94%、5.20%、3.88%、3.10%、2.51%、2.29%、1.96%、1.91%、1.79%、1.76%、1.40%、1.31%、1.29%、1.16%、1.09%、1.05%、1.03%、1.02%，其他占53.39%。

2.3 細(xì)菌群落組成差異

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)下門水平的細(xì)菌分布如圖1所示，不同樣品組的優(yōu)勢(shì)菌門(豐度大于10%的菌門)有所不同。水體的優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門(36.19%)、變形菌門(26.38%)、藍(lán)細(xì)菌門(12.23%)和擬桿菌門(12.06%)；底泥的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(50.73%)和擬桿菌門(12.49%)；蕹菜根際的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(50.15%)、藍(lán)細(xì)菌門(17.21%)和擬桿菌門(15.22%)；蕹菜根表的優(yōu)勢(shì)菌門為藍(lán)細(xì)菌門(44.30%)、變形菌門(28.94%)和擬桿菌門(10.74%)；暗紋東方鲀腸道的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(32.41%)、Epsilonbacteraeota(25.36%)、藍(lán)細(xì)菌門(13.54%)和擬桿菌門(10.01%)；凡納濱對(duì)蝦腸道的優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門(46.66%)和變形菌門(21.92%)。

圖1 基于門水平的細(xì)菌群落組成

主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖2所示，其中，PCoA分析獲得主成分PC1的方差貢獻(xiàn)率為23.85%，主成分PC2的方差貢獻(xiàn)率為17.58%。每組3個(gè)樣品間距離較近，這表明這些樣品的微生物群落組成較為相似。水體、底泥、蕹菜根際、蕹菜根表、暗紋東方鲀腸道和凡納濱對(duì)蝦腸道微生物群落各自分開，微生物群落分布不同。

圖2 主坐標(biāo)分析結(jié)果

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)下屬水平的細(xì)菌分布如圖3所示，不同樣品組的優(yōu)勢(shì)菌屬有所不同。水體的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為hgcI_clade (12.11%)、CL500-29_marine_group (8.76%)、擬浮絲藻屬Planktothricoides_SR001(6.51%)和熱紅球菌屬(5.80%)；底泥的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為硫桿菌屬Thiobacillus(7.48%)和norank_f_Steroidobacteraceae (7.39%)；蕹菜根際的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為紅桿菌屬(8.89%)、湖絲藍(lán)細(xì)菌屬Limnothrix(3.72%)、黃桿菌屬Flavobacterium(2.14%)和氫噬胞菌屬Hydrogenophaga(1.65%)；蕹菜根表面的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f_Nostocaceae(18.63%)、蓋絲藻屬_PCC-7015Geitlerinema_PCC-7105(10.15%)、Alkalinema_CENA528 (5.98%)和紅桿菌屬(4.27%)；暗紋東方鲀腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬 (28.93%)、弓形菌屬 (25.36%)、norank_f_norank_o_Chloroplast (13.31%)、短螺旋體菌屬 (9.56%)和Elizabethkingia(8.56%)和支原體屬(5.32%)；凡納濱對(duì)蝦腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬 (32.64%)、Candidatus_Bacilloplasma(7.32%)、浮絲藻屬Planktothrix_NIVA-CYA_15 (6.15%)、Timonella(5.56%)、LD29 (2.17%)、norank_f_Rhizobiales_Incertae_Sedis(2.13%)和微小桿菌屬Exiguobacterium(1.93%)。

圖3 基于屬水平的細(xì)菌群落組成

2.4 池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中主要功能菌群分布

從表2可見：池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中，參與氮循環(huán)的有益菌主要包括硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及固氮菌，其中，硝化細(xì)菌總體相對(duì)豐度排序?yàn)檗巢烁?蕹菜根際>底泥>凡納濱對(duì)蝦腸道≈暗紋東方鲀腸道≈水體，蕹菜根表的硝化細(xì)菌豐富度顯著高于水體、鲀和蝦腸道(P<0.05)，其他各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；反硝化細(xì)菌總體相對(duì)豐度排序?yàn)檗巢烁H>蕹菜根表>凡納濱對(duì)蝦腸道>水體>底泥>暗紋東方鲀腸道，蕹菜根際的反硝化細(xì)菌顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；固氮菌總體相對(duì)豐度排序?yàn)樗w>蕹菜根際>蕹菜根表>凡納濱對(duì)蝦腸道>底泥≈暗紋東方鲀腸道，水體固氮菌相對(duì)豐度與蕹菜根際無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于蕹菜根表、蝦腸道、底泥和鲀腸道(P<0.05)；底泥中參與硫循環(huán)的硫桿菌Thiobacillus相對(duì)豐度顯著高于其他各組(P<0.05)，水體中可有效利用多種碳水化合物的有益菌屬hgcI_clade和CL500-29_marine_group顯著高于其他各組(P<0.05)，凡納濱對(duì)蝦腸道中具有生物降解作用的紅球菌屬Rhodococcus相對(duì)豐度顯著高于其他各組(P<0.05)。

表2 池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中有益菌屬的相對(duì)豐度

3 討論

3.1 魚菜共生系統(tǒng)不同組成的微生物群落結(jié)構(gòu)差異

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中的水體、底泥、蕹菜根系中的微生物群落在維持該系統(tǒng)的生態(tài)平衡中發(fā)揮了不同的作用。底泥是水體長(zhǎng)期積存的沉積物，是水體的重要組成部分之一,水體底泥中含有的動(dòng)植物殘骸、有機(jī)物、金屬物質(zhì)等，以及復(fù)雜的好氧厭氧環(huán)境，為微生物的生長(zhǎng)和活動(dòng)提供了環(huán)境條件，使得水體底泥中蘊(yùn)藏著大量的細(xì)菌和古菌[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)，底泥中的微生物豐富度和多樣性最高，這與底泥自身性質(zhì)有關(guān)。水體是水產(chǎn)動(dòng)物賴以生存的環(huán)境，水環(huán)境的穩(wěn)定性與微生物的多樣性密切相關(guān)，當(dāng)水體微生物多樣性下降時(shí)，就會(huì)增加養(yǎng)殖病害暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)，水體的豐富度和多樣性低于底泥和蕹菜根際及根表，這可能與養(yǎng)殖過程中換水有關(guān)。植物的健康與土壤微生物多樣性有關(guān)[9]，植物根際是植物與微生物互作的重要生境場(chǎng)所，是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。根際微生物群落被認(rèn)為是土壤微生物群落中的一個(gè)子系統(tǒng)[10]。方敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，馬纓杜鵑根系依次從根際、根表、根內(nèi)，細(xì)菌α-多樣性顯著下降。本研究結(jié)果與之類似，蕹菜根際微生物的豐富度和多樣性均高于根表。水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)主要由宿主自身及外界生長(zhǎng)環(huán)境因素等決定[11-12]。本研究中蝦腸道微生物的豐富度和多樣性均高于鲀腸道，這可能與二者的食性差異有關(guān)。綜上可知，不同的組成(底泥、水體、蕹菜根際與根表、養(yǎng)殖對(duì)象腸道)之間微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。

3.2 魚菜共生系統(tǒng)不同組成的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落

在淡水水體及底泥中，α-變形菌門和放線菌門分布最為廣泛[13]，除此之外，Zwart 等[14]發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門也是不同淡水環(huán)境(湖泊和河流)常見的優(yōu)勢(shì)菌門。變形菌門和放線菌門同樣也是植物根際微生物群落的主要優(yōu)勢(shì)菌門[10,15]。李建柱等[16]研究發(fā)現(xiàn)，魚菜共生模式下蕹菜根系微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，這與本研究結(jié)果一致，而養(yǎng)殖水生動(dòng)物腸道微生物優(yōu)勢(shì)菌群有所不同。李建柱等[17]研究發(fā)現(xiàn)，魚菜共生模式下草魚、鰱、鳙和鯽腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢(shì)菌門為梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門等。本研究中，暗紋東方鲀腸道的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、Epsilonbacteraeota、藍(lán)細(xì)菌門和擬桿菌門，凡納濱對(duì)蝦腸道優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門和變形菌門，這可能與養(yǎng)殖對(duì)象自身及環(huán)境的差異有關(guān)。

池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)水體的主要優(yōu)勢(shì)菌屬中包含有可能有效利用多種碳水化合物的有益菌屬hgcI_clade和 CL500-29_marine_group[18-19]，而可能引起水華的Planktothricoides_SR001[20]相對(duì)豐度較低。硫桿菌屬細(xì)菌可用來濾除污水污泥及河流沉積物中重金屬[21]。底泥中的硫桿菌屬性相對(duì)豐度較高，可促進(jìn)系統(tǒng)硫元素循環(huán)，減少重金屬的富集，其氧化作用還可為植物提供可利用的硫酸態(tài)硫素營(yíng)養(yǎng)。植物根系微生物在魚菜共生系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，根際微生物主要生活在外界的土壤環(huán)境中，將無(wú)機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)料。根表微生物主要生活在根系的表面，可形成厚密的套膜，保護(hù)內(nèi)部的根系，抵御病原物入侵。本研究中，蕹菜根際主要優(yōu)勢(shì)菌屬為紅桿菌屬、湖絲藍(lán)細(xì)菌屬、黃桿菌屬和氫噬胞菌屬，蕹菜根表的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為norank_f_Nostocaceae、蓋絲藻屬_PCC-7105、Alkalinema_CENA528和紅桿菌屬。紅桿菌屬是可高效凈化水質(zhì)，兼具反硝化作用的一類光合細(xì)菌[22]，其在生物膜形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。氫噬胞菌屬是一類反硝化細(xì)菌。黃桿菌在有機(jī)污染物的分解代謝中起著重要的作用[24]。表明池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中蕹菜根系有益菌的分布，有利于充分利用水體養(yǎng)分，凈化水質(zhì)。

本研究中，池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中的凡納濱對(duì)蝦腸道微生物以紅球菌屬為主。紅球菌還具有較強(qiáng)的生物降解去污能力，多項(xiàng)研究顯示，從紅球菌屬中分離出高效的苯酚降解菌株[25-26]，此外，有些紅球菌種是人和動(dòng)物的致病菌[27]。而暗紋東方鲀腸道的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬、弓形菌屬、norank_f_norank_o_Chloroplast、短螺旋體菌屬、Elizabethkingia和支原體屬。其中，葡萄球菌屬屬于反硝化細(xì)菌，多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾?。还螚U菌是一種人畜共患的食源性和水源性病原菌[28]；短螺旋體菌屬主要會(huì)感染豬腸道導(dǎo)致腹瀉[29]，而對(duì)魚體的影響尚不清楚；Elizabethkingia屬多為致病菌，可威脅人類生命，尤其是免疫缺陷的患者[30]。凡納濱對(duì)蝦生活在水體的底部，主要清理殘餌及魚糞，而暗紋東方鲀生活在水體中間區(qū)域，會(huì)捕食少量病蝦。本研究中的養(yǎng)殖對(duì)象腸道中既有有益菌也有致病菌屬，這可能與不同動(dòng)物的生活習(xí)性有關(guān)。

3.3 魚菜共生系統(tǒng)不同組成的主要功能菌群分布

養(yǎng)殖廢水中主要含有磷和氮，在魚菜共生系統(tǒng)中要將水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中剩余的這些無(wú)機(jī)或有機(jī)物廢物轉(zhuǎn)化為植物可利用的營(yíng)養(yǎng)素，則依賴于各種微生物群，其中，硝化細(xì)菌發(fā)揮著關(guān)鍵作用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過微生物硝化和反硝化轉(zhuǎn)化被植物同化[31]。此外，氨氮的轉(zhuǎn)化也離不開亞硝化細(xì)菌。亞硝化細(xì)菌廣泛分布于土壤、淡水和海水中，但實(shí)際上它在自然環(huán)境的整個(gè)細(xì)菌種群中僅占很少的一部分。無(wú)論是水體底泥中的微生物還是植物根際的微生物，在魚菜共生系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán)中均發(fā)揮了重要作用[32]。本研究中發(fā)現(xiàn)，硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及固氮菌等分布在池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)的各個(gè)部分，但相對(duì)豐度有所差異。硝化細(xì)菌主要分布于蕹菜的根際與表面、底泥，反硝化細(xì)菌主要分別于蕹菜的根際，固氮菌主要分布于水體、蕹菜根際與表面。由此可見，養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水生植物在氮循環(huán)中發(fā)揮了重要作用，在池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中添加微生物制劑對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及養(yǎng)殖作用效果有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1) 池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中不同組成的微生物群落分布有所不同。水體的優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門和變形菌門，底泥的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門和擬桿菌門，蕹菜根際及根表的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門和藍(lán)細(xì)菌門，而暗紋東方鲀腸道則以厚壁菌門為主，凡納濱對(duì)蝦腸道以放線菌門和變形菌門為主。

2) 池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)中的功能性細(xì)菌分布略有不同。系統(tǒng)中的硝化細(xì)菌在蕹菜根表相對(duì)豐度顯著高于其他各組，蕹菜根際的反硝化細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于其他各組，水體和蕹菜根際固氮菌的相對(duì)豐度顯著高于蝦腸道、底泥和鲀腸道。

3) 養(yǎng)殖對(duì)象腸道中既有有益菌也有致病菌屬，池塘魚菜立體種養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)加強(qiáng)病害防控工作，確保水產(chǎn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)。