金槍魚骨膠原肽對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎小鼠的預(yù)防效果

舒聰涵，相興偉，孫繼鵬，王家星，廖妙飛，鄧尚貴，周宇芳,，鄭 斌,

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316021；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316021；3.浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州 310000）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種反復(fù)發(fā)作的非特異性腸道炎癥性疾病。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病的一種，其病變部位以直腸和乙狀結(jié)腸為主，在結(jié)腸黏膜及黏膜下層形成炎癥性病變。該病病程漫長常反復(fù)發(fā)作，臨床表現(xiàn)為間歇性腹瀉帶血、里急后重等[1]。該病過去常見于西方發(fā)達(dá)國家，近年來亞洲地區(qū)發(fā)病率也出現(xiàn)上升趨勢[2]。在我國就有1.2 億人群患有腸胃疾病，消化性潰瘍發(fā)病率達(dá)10%以上[3]，然而，其根本的病因及發(fā)病機制尚不清楚，目前考慮是遺傳、免疫、腸道菌群和環(huán)境等多因素綜合作用的結(jié)果[4]?，F(xiàn)在常用的治療藥物包括抗炎藥、氨基水楊酸鹽、抗腹瀉藥、皮質(zhì)類固醇、抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、生物制劑等[5-6]，但這些藥物在發(fā)揮藥效的同時還會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，長期服用會導(dǎo)致機體免疫力下降，更容易感染疾病，對健康產(chǎn)生不利影響。因此，非常有必要尋找并開發(fā)安全有效、無副作用的新型活性物質(zhì)，為結(jié)腸炎的防治提供新策略。

膠原蛋白是腸黏膜細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的主要結(jié)構(gòu)蛋白。病理生理學(xué)上認(rèn)為UC 患者黏膜和黏膜下區(qū)域的潰瘍是由于ECM 過度降解所導(dǎo)致[7]。膠原蛋白和膠原蛋白水解物都被證明是治療外傷性潰瘍的良好基質(zhì)[8]。據(jù)報道，河豚Ⅰ型膠原蛋白可以有效抑制由2，4，6-三硝基苯磺酸誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎癥狀，抑制結(jié)腸細(xì)胞凋亡和過氧化損傷[9]。王志聰?shù)萚10]發(fā)現(xiàn)鱈魚皮膠原肽能夠通過增強大鼠胃黏膜屏障及機體抗自由基氧化水平，產(chǎn)生對急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用。Azuma 等[11]研究表明魚鱗膠原蛋白肽在DSS 誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎模型中發(fā)揮了抗炎作用。

骨膠原肽是骨膠原蛋白的水解產(chǎn)物，其抗炎[12]、抗氧化[13-14]、降血壓[15-16]、抑菌[17]等生物活性被相繼報道。金槍魚作為一種深海魚類，素來以營養(yǎng)價值高、純天然、無污染等優(yōu)點享譽國際市場，深受消費者歡迎。在金槍魚加工過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其中魚骨約占副產(chǎn)物總量的20%～30%，沒有得到很好的開發(fā)利用。有研究指出，金槍魚骨中蛋白質(zhì)含量為57.2%[18]，可以作為膠原蛋白提取的良好原料。譚洪亮等[19]從金槍魚骨中酶解和分離純化得到具有抗氧化活性的膠原肽，可以用于抗氧化相關(guān)的功能食品、藥物或者食品添加劑；Lee 等[20]研究發(fā)現(xiàn)金槍魚骨中分離得到的骨膠原肽對自發(fā)性高血壓大鼠有降壓作用，可以應(yīng)用于抗高血壓保健品和藥物中；Ding 等[21]研究發(fā)現(xiàn)金槍魚骨膠原水解物能顯著促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖和分化，具有成骨作用。但是，對于金槍魚骨膠原肽是否具有預(yù)防結(jié)腸炎的效果尚未見報道。因此本實驗以金槍魚魚骨為原料制備骨膠原肽，研究骨膠原肽對DSS 誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的預(yù)防作用，為開發(fā)預(yù)防和改善潰瘍性結(jié)腸炎的功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康SPF 級雄性ICR 小鼠 24 只，4 周齡，體重（20±1）g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005；小鼠標(biāo)準(zhǔn)糧 蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）美國MPBIO 公司；二胺氧化酶（DAO）試劑盒 森貝伽生物科技有限公司；內(nèi)毒素（LPS）試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市億能實驗儀器廠；Synergy H1 酶標(biāo)儀 美國BioTek；TGL-16M 高速冷凍離心機 上海如湘儀器有限公司；BSA224S 分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；Leica 倒置熒光顯微鏡 德國Leica Microsystems。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚骨膠原肽的制備 參照甄守艷等[22]的方法加以修改確定骨膠原肽的制備工藝流程。首先將金槍魚魚骨經(jīng)過胃蛋白酶酶解3 h，接著120 ℃高溫高壓蒸煮30 min，再添加2%的食用小蘇打堿處理2 h，經(jīng)過干燥等步驟后粉碎過篩得到魚骨粉。用動物蛋白酶酶解魚骨粉制備骨膠原肽，主要操作步驟是魚骨粉質(zhì)量濃度調(diào)整為0.1 g/mL，加入2%的動物蛋白酶，水解溫度為50 ℃，酶解8 h，95 ℃滅酶10 min，終止酶解反應(yīng)。以6000 r/min 離心15 min，棄沉淀，得到酶解液。根據(jù)實驗室前期研究成果，將骨膠原肽酶解液分別過截留量為1000 和250 Da 的卷式膜，收集250～1000 Da 的分子質(zhì)量范圍的骨膠原肽凍干備用。

1.2.2 動物實驗 ICR 小鼠自由采食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，按體重隨機分為3 組，分別為正常組，造模組和骨膠原肽組，每組各8 只。整個實驗周期為23 d，正常組小鼠在整個實驗周期中每日灌胃生理鹽水，并自由飲用蒸餾水；造模組小鼠在整個實驗周期中每日灌胃生理鹽水，前14 d 自由飲用蒸餾水，從第15 d開始飲水更換為含有3.5% DSS 溶液持續(xù)8 d；骨膠原肽組小鼠前14 d 自由飲用蒸餾水，從第15 d 開始飲水更換為含有3.5% DSS 溶液連續(xù)8 d，整個實驗周期中每日灌胃0.3 g/kg 的骨膠原肽，劑量設(shè)置依據(jù)王志聰?shù)萚10]的研究成果。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2 ℃）；濕度60%～70%；日光燈采光，光暗周期12/12 h（光照時間為8：00～20：00）。本實驗研究獲得浙江海洋大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2019003）。

1.2.3 體重記錄及DAI 評分 每天記錄小鼠體重，造模開始每天記錄大便的性狀，并收集以用來測試小鼠隱血的狀況，之后依據(jù)以下評分標(biāo)準(zhǔn)（表1）進(jìn)行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 DAI scoring standard

1.2.4 樣本收集 造模第8 d，各組小鼠禁食24 h（不禁水）。第8 d 結(jié)束后，對各組小鼠進(jìn)行眼球取血，收集血清。隨后頸椎脫臼法處死，收集小鼠胸腺、脾臟、肝臟、心臟、腎臟和結(jié)腸等樣本。

1.2.5 臟器指數(shù)測定 取肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺，用PBS 緩沖液漂洗干凈后用濾紙吸干水分，稱重，計算各臟器指數(shù)。

1.2.6 結(jié)腸長度測量及HE 染色 小鼠處死后取全段結(jié)腸，測量并記錄自然長度，并比較各組小鼠結(jié)腸長度的變化。取1 cm 病變結(jié)腸組織固定于10%多聚甲醛溶液，然后依次經(jīng)過修塊、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等程序制備石蠟切片，置于伊紅染液中染色，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.7 ELISA 測定血清中LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力 末次灌胃后對所有小鼠進(jìn)行眼球取血，在4 ℃冰箱內(nèi)過夜凝血。次日取出后，2000 r/min離心10 min（4 ℃）；取上清于干凈的離心管中，于-80 ℃保存，直到待測時取出。使用試劑盒檢測血清中LPS、DAO 含量以及SOD、GSH-Px 活力。

1.2.8 ELISA 測定結(jié)腸組織中LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力 取一段結(jié)腸約1 cm，按1:9 質(zhì)量體積比加入生理鹽水，用勻漿機對組織進(jìn)行研磨，然后置于冷凍離心機中3000 r/min 離心10 min（4 ℃）。吸取上清液到離心管中，即為10%的結(jié)腸組織勻漿液。使用試劑盒檢測結(jié)腸組織勻漿液中LPS、DAO含量以及SOD、GSH-Px 活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗均重復(fù)三次，實驗結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用One-way-ANOVA 方法進(jìn)行多組比較，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：P＜0.05 表示差異顯著；P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重及DAI 變化情況

小鼠體重變化百分比情況如圖1 所示，以初始體重為標(biāo)準(zhǔn)，造模前各組小鼠體重變化總體呈上升趨勢。第15 d，除正常組外，其余小鼠均飲用3.5%的DSS 溶液開始造模。造模開始后，正常組小鼠體重仍保持上升趨勢；造模組和骨膠原肽組體重變化波動不穩(wěn)定，造模第4 d，體重開始明顯下降。骨膠原肽組與造模組相比，雖然小鼠體重也呈現(xiàn)下降趨勢，但體重下降幅度小于造模組。

圖1 各組小鼠體重變化（n=8）Fig.1 Body weight of mice in each group (n=8)

疾病活動指數(shù)DAI 反映了小鼠體重變化、糞便松散程度以及糞便的出血情況。DAI 評分越高，說明結(jié)腸病變越嚴(yán)重。如圖2 所示，正常組體重持續(xù)增長，大便硬度適中，橢圓狀，無稀便及粘液血便，DAI 評分在0 左右。造模結(jié)束后造模組小鼠均表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀，肉眼可見血便或稀便，同時伴隨體重下降、飲食飲水量減少、活動減少、毛色變差等，故其DAI 評分顯著升高，這表明小鼠結(jié)腸炎模型造模成功。骨膠原肽灌胃作用于結(jié)腸炎小鼠后，糞便逐漸成型，少有稀便，小鼠生理狀況得到了一定的改善，因此骨膠原肽組DAI 評分相對低于造模組。

圖2 各組小鼠結(jié)腸炎的DAI 評分（n=8）Fig.2 DAI score of mice in each group（n=8）

2.2 骨膠原肽對DSS 結(jié)腸炎小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2 的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可知，造模組小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高，胸腺指數(shù)則明顯降低，與正常組相比有顯著性差異（P＜0.05）。與造模組相比，骨膠原肽灌胃能顯著抑制肝脾指數(shù)升高（P＜0.05），顯著抑制胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）。腎臟和心臟指數(shù)各組之間均沒有顯著性差異（P＞0.05）。DSS 會造成肝脾腫大，可能是由于感染或免疫系統(tǒng)的活化從而導(dǎo)致肝脾重量增加。肝脾增加的重量越多，說明腸道炎癥越嚴(yán)重[23]。因此，隨著癥狀加重，機體免疫能力全面下降，使得胸腺器官萎縮而重量降低。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)變化表（n=8）Table 2 Changes of organ index of mice in each group（n=8）

2.3 骨膠原肽對DSS 結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

小鼠結(jié)腸作為小鼠腸道的重要組成部分，參與吸收物質(zhì)供給自身營養(yǎng)，為機體的行動提供能量。如圖3 所示，正常組的小鼠結(jié)腸呈淡粉色，糞便呈完整顆粒狀。在DSS 作用下，造模組小鼠結(jié)腸呈暗紅色，糞便不成形，有臭味，充血、水腫現(xiàn)象嚴(yán)重，結(jié)腸長度同正常組比較明顯縮短（P＜0.05）。經(jīng)過骨膠原肽灌胃后，上述情況得到減輕，結(jié)腸長度相比造模組有所增長（P＜0.05），但與正常組的小鼠結(jié)腸相比，仍具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠結(jié)腸長度變化Fig.3 Colon length changes of mice in each group

2.4 骨膠原肽對DSS 結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

各組小鼠結(jié)腸組織病理切片HE 染色經(jīng)放大200 倍后的觀察結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，腸絨毛正常，隱窩及腺體結(jié)構(gòu)完整，含有豐富的杯狀細(xì)胞，黏膜層完整，未見明顯炎細(xì)胞浸潤；造模組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，腸腺與隱窩破壞嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞缺失，黏膜層及黏膜下層有大量炎細(xì)胞浸潤；與造模組相比，骨膠原肽灌胃后小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較完整，腺體排列較整齊，保留了大量的杯狀細(xì)胞，出現(xiàn)可見的隱窩結(jié)構(gòu)，炎細(xì)胞浸潤明顯減少，改善效果較為明顯。

圖4 各組小鼠結(jié)腸病理組織切片（200×）Fig.4 Pathological sections of colon of mice in each group (200×)

2.5 骨膠原肽對DSS 結(jié)腸炎小鼠血清中LPS、DAO含量和SOD、GSH-Px 活力的影響

如圖5 所示，相較于正常組，造模組小鼠血清中LPS 含量、DAO 含量極顯著上升（P＜0.01）；骨膠原肽組小鼠與造模組相比，極顯著地降低了LPS 和DAO 的含量（P＜0.01），這表明骨膠原肽能夠有效恢復(fù)腸道黏膜屏障損傷。進(jìn)一步對血清中的SOD、GSH-Px 活力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)造模組小鼠的SOD 和GSH-Px 活力均降低，與正常組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。與造模組相比較，骨膠原肽灌胃后小鼠的SOD 和GSH-Px 活力則極顯著地提高（P＜0.01），這表明骨膠原肽在結(jié)腸炎中起到一定的抗氧化效果。

圖5 骨膠原肽對結(jié)腸炎小鼠血清LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影響Fig.5 Effects of TBCP on serum LPS,DAO contents and SOD,GSH-Px activity in colitis mice

2.6 骨膠原肽對DSS 結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影響

檢測結(jié)腸組織中的LPS、DAO 含量，可以發(fā)現(xiàn)與正常組相比，造模組小鼠結(jié)腸組織的LPS 含量極顯著升高（P＜0.01），DAO 含量顯著升高（P＜0.05）；與造模組相比，骨膠原肽組小鼠的LPS 和DAO 含量極顯著降低（P＜0.01），結(jié)果見圖6，這表明骨膠原肽對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎的腸道黏膜屏障損傷恢復(fù)有效。另外，與正常組比，造模組小鼠的SOD 及GSHPx 活力顯著下降（P＜0.05）；與造模組相比，骨膠原肽組小鼠的SOD、GSH-Px 活力均極顯著性上升（P＜0.01），表明骨膠原肽能增強小鼠的抗氧化能力，減緩DSS 造成機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 骨膠原肽對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織LPS、DAO 含量和SOD、GSH-Px 活力的影響Fig.6 Effects of TBCP on LPS,DAO content and SOD,GSH-Px activity in colonic tissue of colitis mice

3 討論

UC 模型的建立是研究生理病理工作的第一步，近年來，關(guān)于UC 在研究中常用的動物疾病模型建立方法，大致可以分為化學(xué)藥物誘導(dǎo)、免疫學(xué)方法誘導(dǎo)和通過基因工程技術(shù)誘導(dǎo)[24]。常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑有TNBS、惡唑酮、醋酸、葡聚糖硫酸鈉等，其中葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎病變相似，并且簡單易行，成功率高，重復(fù)性好[25]，所以成為試驗研究中常用的建模方法。

主流學(xué)說認(rèn)為UC 發(fā)病與細(xì)胞免疫、氧化應(yīng)激和自身免疫有關(guān)，認(rèn)為自身免疫異常和氧化應(yīng)激功能障礙在其發(fā)病機制中起到了重要的作用[26]。當(dāng)生物體處于正常狀態(tài)時，由于其本身存在一套完整且相互制約平衡的氧化和抗氧化防御系統(tǒng)[27]，因此能夠很好地防止活性氧對組織和細(xì)胞的損傷，而過量產(chǎn)生的活性氧是誘導(dǎo)UC 發(fā)病過程中組織損傷和潰瘍形成的關(guān)鍵因素。SOD 作為催化超氧化物歧化的酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能夠清除自由基，延緩衰老，并且在臨床上有治療炎癥的作用[23]，GSH-Px 不僅可以清除脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫，還可以通過再?；种浦|(zhì)過氧化的再生[28]。SOD 和GSH-Px 酶活的提高能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜，對結(jié)腸組織起保護(hù)作用[29]。LPS 作為內(nèi)毒素在結(jié)腸釋放后會引發(fā)結(jié)腸炎患者腸道炎癥反應(yīng)及微生物生態(tài)失調(diào)[30]，故而LPS 含量能夠間接反應(yīng)腸道黏膜免疫屏障的損傷程度。當(dāng)腸道黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜通透性升高，腸黏膜上皮細(xì)胞胞內(nèi)釋放DAO 含量增加，并進(jìn)入腸細(xì)胞間隙、淋巴管和血液，DAO 水平定性地反應(yīng)腸道損傷和修復(fù)情況。

4 結(jié)論

本實驗選擇采用3.5% DSS 溶液自由飲用8 d誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，以評價金槍魚骨膠原肽對DSS 誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎的預(yù)防效果。造模第3 d 開始，小鼠糞便呈隱血陽性，第5 d 出現(xiàn)肉眼可見血便或稀便，同時伴隨體重下降、飲食飲水量減少、活動減少和毛色變差等癥狀，隨著造模時間的延長愈加明顯。同時，實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，DSS 造模組小鼠DAI 評分升高，肝脾指數(shù)升高（P＜0.05），胸腺指數(shù)降低（P＜0.05），結(jié)腸長度縮短（P＜0.05），結(jié)腸隱窩與腺體破壞嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞缺失，大量炎細(xì)胞浸潤，以上結(jié)果表明急性結(jié)腸炎造模成功。預(yù)防性的提前給予骨膠原肽能夠減輕急性結(jié)腸炎的癥狀，增加結(jié)腸長度（P＜0.05），對結(jié)腸組織病理學(xué)進(jìn)行觀察，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞缺失等病理改變亦得到了一定程度的減輕。因此推測金槍魚骨膠原肽對于DSS 誘導(dǎo)的急性潰瘍性結(jié)腸炎具有一定的預(yù)防作用。

此外，金槍魚骨膠原肽均能使血清和結(jié)腸組織中的SOD 和GSH-Px 酶活力極顯著增加（P＜0.01），與劉寧等[31]從抗氧化角度研究發(fā)酵豆乳對DSS 誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠起保護(hù)作用的結(jié)果相符。這表明金槍魚骨膠原肽具有一定的抗氧化能力，可能通過清除體內(nèi)過量活性氧、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的方式對急性潰瘍性結(jié)腸炎起到預(yù)防作用。另外，預(yù)防性的提前給予金槍魚骨膠原肽能極顯著降低血清和結(jié)腸組織中LPS 和DAO 的含量（P＜0.01），這與徐鳳等[32]、鐘元帥等[33]的研究結(jié)果相似，表明金槍魚骨膠原肽能在一定程度上修復(fù)受損的腸道黏膜。綜上所述，本研究表明金槍魚骨膠原肽對DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎具有顯著的預(yù)防效果，推測其通過提高機體的抗氧化能力，修復(fù)腸道黏膜屏障損傷發(fā)揮作用。研究結(jié)論提示，采用金槍魚魚骨膠原肽預(yù)防結(jié)腸炎具有可行性，并且對金槍魚骨資源的開發(fā)利用具有一定的積極意義。