采自甘南州的21株野生羊肚菌的分子學(xué)鑒定

楊琴 王三喜 王海峰 冶曉燕

摘要：甘南藏族自治州境內(nèi)高寒陰濕溫差大，土壤肥力高，適宜羊肚菌生長(zhǎng)。經(jīng)對(duì)采自甘南藏族自治州的野生羊肚菌進(jìn)行組織分離，獲得21份菌絲培養(yǎng)物，并對(duì)其采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段聯(lián)合矩陣序列分析鑒定。結(jié)果表明，21個(gè)供試菌株均屬黑色羊肚菌支系，其中19株為三地羊肚菌（Morchella eohespera），2株為羊肚菌屬M(fèi)el-13，且這2種羊肚菌目前已實(shí)現(xiàn)人工栽培。

關(guān)鍵詞：甘南藏族自治州;羊肚菌;分子鑒定;序列聯(lián)合分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S646.7? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2021）05-0050-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.05.012

Molecular Identification of 21 Strains of Wild Morchella spp. from Gannan Tibetan Autonomous Prefecture

YANG Qin 1， WANG Sanxi 2， WANG Haifeng 2， YE Xiaoyan 3

（1. Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China;2. Agricultural Science Research Institute of Gannan Tibetan Autonomous Prefecture， Gannan Gansu 747000， China;3. College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：Gannan Tibetan Autonomous Prefecture has high cold damp， large temperature difference between day and night， and fertile soil， which is very suitable for the growth of Morchella spp. 21 mycelium cultures were obtained by tissue isolation from wild Morchella collected from Gannan Tibetan Autonomous Prefecture in this study， and were identified by ITS， ef1-α， rpb1 and rpb2 joint matrix sequence analysis. The results showed that all the 21 strains were Elata Clade， 19 of which were Morchella eohespera， and 2 strains were Morchella spp. Mel-13.， Moreover， these two kinds of Morchella have been cultivated artificially.

Key words：Gannan Tibetan Autonomous Prefecture;Morchella spp.;Molecular identification;Sequence joint analysis

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬子囊菌亞門(mén)（Ascomycota）盤(pán)菌綱（Pezizomycetes）盤(pán)菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae），是一類(lèi)世界公認(rèn)的珍稀食藥同源性真菌，也是目前國(guó)際上最重要的貿(mào)易真菌之一[1 ]，其子實(shí)體、菌絲、液體培養(yǎng)物中含有多糖、酶、脂肪酸、氨基酸、維生素、抗生素、甾醇等多種有效成分，在抗菌、抗腫瘤、抗氧化、保腎護(hù)肝、提高免疫力等方面均有顯著作用[2 ]，獨(dú)含的脯氨酸類(lèi)似物具特殊香味，已被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品以及食品添加劑領(lǐng)域[3 ]。

羊肚菌是一類(lèi)喜涼的大型真菌，主要分布在北溫帶和寒溫帶地區(qū)，目前已知的羊肚菌分為3大類(lèi)群：黃色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）以及變紅羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）[4 ]，共有61種，中國(guó)就分布著其中的30種[5 ]。甘南藏族自治州地處青藏高原東北邊緣地區(qū)，境內(nèi)海拔1 173～4 920 m，年平均氣溫1～13 ℃，高寒陰濕溫差大，土壤為黑土類(lèi)，肥力高、土質(zhì)疏松，得天獨(dú)厚的環(huán)境極利于羊肚菌生長(zhǎng)[6 ]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，利用特異性基因片段進(jìn)行物種鑒定已是當(dāng)下生物學(xué)研究中常用的手段之一，目前大多數(shù)研究利用ITS片段就能對(duì)試驗(yàn)對(duì)象做出鑒定，但有研究顯示，利用ITS序列僅能識(shí)別出約羊肚菌屬76%的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)物種，而利用ITS+ef1-a+rpb1+rpb2 多基因聯(lián)合分析，則能鑒定出該屬內(nèi)的所有物種[7 ]。我們對(duì)從甘南藏族自治州獲得的野生羊肚菌菌絲培養(yǎng)物采用ITS、ef1-α、rpb1以及rpb2片段聯(lián)合矩陣序列分析進(jìn)行分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，旨在準(zhǔn)確鑒定甘南州野生羊肚菌資源類(lèi)型，為當(dāng)?shù)匮蚨蔷Y源的科學(xué)利用提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 供試菌株? ? 2019 — 2020年，在羊肚菌子實(shí)體發(fā)生季對(duì)甘南藏族自治州夏河縣、卓尼縣、迭部縣的野生羊肚菌進(jìn)行了采集，通過(guò)組織分離共得到21份可產(chǎn)生菌核的菌絲培養(yǎng)物，編號(hào)為GN-M1、GN-M2、GN- M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6、GN-M7、GN-M8、GN-M9、GN-M10、GN-M11、GN- M12、GN-M13、GN-M14、GN-M15、GN- M16、GN-M17、GN-M18、GN-M19、GN- M20、GN-M21。

1.1.2? ? 藥品和試劑? ? PDA合成培養(yǎng)基、HP Fungal DNA Kit D3195-01試劑盒、瓊脂糖、TAE等，均由北京奧科鼎盛生物公司提供。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? DNA提取? ? 采用柱式HP Fungal DNA Kit D3195-01試劑盒提取供試菌株菌絲總DNA。

1.2.2? ? DNA擴(kuò)增? ?本試驗(yàn)需要4對(duì)擴(kuò)增引 物[8 ]，具體序列詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增反應(yīng)體系：采用25 μL體系，正反引物各1 μL，2× Taq Mix 酶12.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)充至25 μL;擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性10 s，復(fù)性15 s（ITS 50 ℃、ef1-α 58 ℃、rpb1 55 ℃、rpb2 54 ℃），72 ℃延伸20 s， 35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.2.3? ?擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與測(cè)序? ?將1.2.2中引物ITS、ef1-α、rpb1、rpb2的擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖電泳（100 mL 1×TAE+1g瓊脂糖）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)完好后送至北京奧科鼎盛生物公司測(cè)序。

1.2.4? ?測(cè)序結(jié)果對(duì)比及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析? ?測(cè)序得到的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST，下載同源性大于99%的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析;分別構(gòu)建ITS、ef1-α、rpb1、rpb2矩陣，在BioEdit中進(jìn)行調(diào)整，最后整合成聯(lián)合矩陣，采用MEGA 7.0 軟件Neighbor-joining 聚類(lèi)分析方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?供試菌株的DNA擴(kuò)增分析

供試菌株的4個(gè)特異性片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。21株供試菌株的4個(gè)特異性片段擴(kuò)增很好，電泳條帶清晰單一。

2.2? ?供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)測(cè)序篩選同源性較高的序列進(jìn)行ITS、ef1- α、rpb1、rpb2序列聯(lián)合矩陣分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，供試菌株分屬于2個(gè)類(lèi)群，其中菌株GN-M1～GN-M18、GN-M21共19株，與Morchella eohespera（三地羊肚菌）親緣關(guān)系近;GN-M19和GN-M20與Morchella sp. Mel-13親緣關(guān)系近。支持率均為99%。

3? ?結(jié)論與討論

采用ITS、ef1-α、rpb1、rpb2序列聯(lián)合矩陣分析對(duì)分離得到的可產(chǎn)核的野生羊肚菌菌絲進(jìn)行了鑒定，確定供試菌株均屬于黑色羊肚菌支系，其中GN-M1、GN-M2、GN- M3、GN-M4、GN-M5、GN-M6、GN-M7、GN-M8、GN-M9、GN-M10、GN-M11、GN- M12、GN-M13、GN-M14、GN-M15、GN- M16、GN-M17、GN-M18、GN-M21為三地羊肚菌（Morchella eohespera）;GN-M19、GN- M20為羊肚菌屬（Mel-13），這2個(gè)種目前已實(shí)現(xiàn)人工栽培[9 ]，為開(kāi)發(fā)甘肅省高寒冷涼區(qū)本土化羊肚菌品種提供了可能。

此次羊肚菌資源調(diào)查所得物種僅有2個(gè)，可能是由采集時(shí)間和地點(diǎn)過(guò)于集中所致。后續(xù)研究應(yīng)該按不同時(shí)段，并且分散調(diào)查地點(diǎn)采集標(biāo)本，更全面的獲得甘南藏族自治州的野生羊肚菌標(biāo)本，以便更準(zhǔn)確地分析該物種在甘南州的分布，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用當(dāng)?shù)匾吧Y源提供依據(jù)。

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（本文責(zé)編：陳? ? 珩）