二代測序技術(shù)在兒童白血病診治中的應(yīng)用

蔡麗雯，徐曉軍

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，浙江 杭州 310003）

二代測序（next-generation sequencing，NGS）又稱下一代測序，是可以并行測定大規(guī)模DNA 堿基對的技術(shù)[1]。近年來，二代測序技術(shù)以其高通量、高靈敏度、易于操作、相對定量等優(yōu)點(diǎn)，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展應(yīng)用。在兒童白血病領(lǐng)域，通過二代測序技術(shù)，越來越多的突變基因被證實(shí)在疾病起源、病情發(fā)展、預(yù)后及復(fù)發(fā)等各個方面具有重要意義。通過檢測追蹤相關(guān)基因，可以對白血病患者的治療反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測及分層治療，使白血病的治療更加精確。此外，不同時間點(diǎn)對白血病相關(guān)突變基因進(jìn)行NGS檢測也能及時發(fā)現(xiàn)新的突變并追蹤白血病克隆演變。本文通過分析國內(nèi)外相關(guān)文章，對二代測序在兒童白血病初診、微小殘留病變監(jiān)測及克隆演變追蹤方面的應(yīng)用進(jìn)行探討。

1 NGS 在初診白血病的應(yīng)用

與以往傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比，NGS 實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模并行測序，可以全面、高效率地發(fā)現(xiàn)更多有意義的突變基因，同時加深對已發(fā)現(xiàn)基因的理解。近年來，NGS 逐漸演變出針對不同目的檢測的多種策略[2]，目前認(rèn)為對于初診白血病具有應(yīng)用價值的主要有高深度Panel、全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNASeq）、全免疫組測序（immune repertoire sequencing，IRseq）和單細(xì)胞測序技術(shù)[3]。這些技術(shù)的結(jié)合可以更好地應(yīng)對白血病基因的復(fù)雜性，也為揭示白血病突變基因與臨床特征及預(yù)后的聯(lián)系提供了更多證據(jù)。

高深度Panel 的檢測范圍相對傳統(tǒng)Panal 而言更全面，包含了血液腫瘤的常見基因，靈敏度可達(dá)到0.03%，對于白血病這類疾病而言針對性強(qiáng)，檢出率高，并使后續(xù)多個基因的監(jiān)測更為便捷[4]。由于其測定目標(biāo)明確，在成本上也就相對低，更具經(jīng)濟(jì)適用性，對于臨床診斷明確的白血病患者而言是一個較好的選擇。但這種方法檢測基因較固定，對于未包含在內(nèi)的基因則無法檢出，也不能發(fā)現(xiàn)新的突變基因。WES 可以測定全部外顯子基因，對于體細(xì)胞與胚系的突變譜都具有檢測意義，靈敏度通常在1%。由于其檢測范圍十分廣泛，可延伸發(fā)現(xiàn)更多有臨床意義的基因，為科研跟臨床提供了重要的研究資料。其對胚系突變的檢測也可將胚系突變遺傳病相關(guān)的白血病與一般的白血病區(qū)分開來，協(xié)助診治。如當(dāng)WES測出白血病患者ATM 基因存在突變時，則提示可能為共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥相關(guān)白血病[5]，需結(jié)合該遺傳病調(diào)整治療方案。正是由于WES 測定內(nèi)容之廣，其價格也比較昂貴。

RNASeq 檢測的是全部編碼氨基酸的序列，涉及到RNA 編輯的過程，與表現(xiàn)出的臨床特征也就更為緊密。尤其是對于融合基因而言，理論上RNASeq可以測出全部融合基因，而不受到染色體斷裂位置及組合基因等因素的限制，也就為發(fā)現(xiàn)新的融合基因提供了方法[6]。在過去的研究中，應(yīng)用RNASeq 發(fā)現(xiàn)了多種新的融合基因[7]，包括IGH-DUX4、ERGDUX4、ETV6-NID1、IKZF1-NUTM1 等[8]，這些基因的發(fā)現(xiàn)為研究融合基因與白血病臨床特征的聯(lián)系提供了更多方向。

IRseq 是對腫瘤細(xì)胞BCR/TCR 的全部克隆進(jìn)行測序，腫瘤細(xì)胞表面存在標(biāo)志性的免疫細(xì)胞受體，可與正常細(xì)胞相區(qū)分，只要初期分辨出腫瘤細(xì)胞的BCR/TCR，后期監(jiān)測的精確度就會大大提高，這項技術(shù)的靈敏度也很高，可以達(dá)到百萬分之一。由于其靈敏度之高，目前認(rèn)為用其追蹤MRD 可以超越傳統(tǒng)的檢測方法。

單細(xì)胞測序技術(shù)針對的則是單個細(xì)胞，對細(xì)胞各自的表達(dá)譜進(jìn)行檢測，分辨出不同細(xì)胞之間的差異，相對于其他幾種技術(shù)是對整個樣本進(jìn)行檢測而言，單細(xì)胞測序技術(shù)在分析腫瘤異質(zhì)性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[9]，所需要的技術(shù)支撐也更為嚴(yán)格，也正因?yàn)槿绱?，價格也相對昂貴，且目前臨床應(yīng)用較少。主要NGS 技術(shù)的比較見表1。

表1 主要NGS 技術(shù)的比較

在NGS 出現(xiàn)之前，已經(jīng)有很多基因被證明與患者的預(yù)后密切相關(guān)，也日漸用于臨床。NGS 的出現(xiàn)及發(fā)展為這方面的研究提供了更多的便利，更多的基因被發(fā)現(xiàn)可能提示一定的臨床特征。目前白血病的危險度跟預(yù)后已經(jīng)有了完整的評價標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病年齡、藥物敏感性、染色體核型、融合基因、MRD 等都具有參考意義。突變基因通過各種途徑表達(dá)為臨床特征的差異，進(jìn)而影響白血病預(yù)后。隨著NGS 對越來越多基因的發(fā)現(xiàn)及其與臨床關(guān)系的探索，白血病預(yù)后的判斷將有望進(jìn)入更精準(zhǔn)的層次。

2 利用NGS 結(jié)果進(jìn)行微小殘留病變（MRD）監(jiān)測

在兒童白血病的治療過程中，MRD 與復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)[10]，需要定期監(jiān)測以評估病情進(jìn)展與治療效果，及時調(diào)整治療方案。對于MRD 過高并在治療過程中未降至預(yù)期值的患者，需要重新評估危險度，提升化療強(qiáng)度或換用敏感藥物，監(jiān)測頻率也會提高。因此，找到一種最適合進(jìn)行MRD 監(jiān)測的檢測方法就格外重要。

以往MRD 的檢測主要有多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（MFC）和實(shí)時定量PCR（RQ-PCR）兩種方法[11]。MFC是通過白血病細(xì)胞異常的免疫表型對其進(jìn)行捕獲，這涉及到不同類型的白血病細(xì)胞表面獨(dú)特的免疫標(biāo)記，區(qū)別于正常的細(xì)胞，可對白血病進(jìn)行分型并檢測MRD。RQ-PCR 則是通過白血病特異的分子標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增后來檢測MRD。近年來一些新興的技術(shù)也逐漸被發(fā)掘，如數(shù)字PCR，其錯誤率相對于傳統(tǒng)技術(shù)更低，靈敏度更高，對于數(shù)據(jù)的分析也相對簡潔，但并不適用于初診白血病的檢測，其應(yīng)用也缺乏標(biāo)準(zhǔn)化[12]。隨著NGS 的發(fā)展，其在MRD 檢測方面的應(yīng)用也越來越成熟，與其他技術(shù)相比，其優(yōu)勢也逐漸顯現(xiàn)。

MRD 評估的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確性跟靈敏度，這就需要能夠針對所有細(xì)胞的具有高度特異性的標(biāo)記。MFC 的靈敏度不定，有時達(dá)不到10-4，正常淋巴細(xì)胞也可能共表達(dá)某些ALL 抗原導(dǎo)致假陽性[13]，患者經(jīng)治療后若出現(xiàn)抗原漂移則會導(dǎo)致假陰性。RQPCR 常用于擴(kuò)增源于白血病細(xì)胞的基因組DNA，這是MRD 檢測中常見的方法，但非常耗時費(fèi)力，不能絕對定量，靈敏度也不是非常高。而NGS 作為測定MRD 的方法，靈敏度跟準(zhǔn)確性都可以得到保證，即使對于低頻突變也能得到可靠結(jié)果，基本可以適用于各種類型的白血病，且在測序過程中不需要依賴于引物，尤其是患者進(jìn)行干細(xì)胞移植后，細(xì)胞的大量增殖使MFC 及RQ-PCR 檢測MRD 存在假陽性可能，此時，應(yīng)用NGS 可以得到更精確的結(jié)果[14]，RD檢測方法比較見表2。

表2 MRD 檢測方法比較

目前，應(yīng)用NGS 檢測白血病MRD 主要有檢測基因突變與檢測白血病特異性IgH/TCR 兩種方法[10]。白血病腫瘤細(xì)胞存在多種不同的基因突變，通過NGS可以高效率地對已知的基因突變進(jìn)行檢測，即只要明確了作為MRD 監(jiān)測的突變點(diǎn)，就可以達(dá)到追蹤MRD 的目的。目前常用高深度Panel 檢測突變基因來進(jìn)行MRD 的追蹤，即在初診時檢測出全部的突變基因，后續(xù)也可應(yīng)用高深度Panel 同時動態(tài)監(jiān)測多個基因的變化，不需要合成特異性的引物，過程相對簡便，省去了傳統(tǒng)方法的繁瑣與重復(fù)性，靈敏度高且穩(wěn)定，適用于各種類型的白血病。另一方面，由于白血病細(xì)胞是惡性增殖的結(jié)果，其IgH/TCR 呈現(xiàn)單克隆[15]，靈敏度跟特異性都比較高，這一特性使其成為了MRD 可靠的檢測靶點(diǎn)，且這種特點(diǎn)是相對穩(wěn)定的，不存在太大的演變，后續(xù)只要追蹤已知IgH/TCR 的豐度就能得到可靠且靈敏的結(jié)果。就如上文提到過的，選用IRseq 技術(shù)可以更加精準(zhǔn)地對MRD進(jìn)行檢測和定量，具體方法是初診時確定腫瘤細(xì)胞上獨(dú)特的IgH/TCR，后續(xù)監(jiān)測其豐度。

3 利用NGS 進(jìn)行白血病克隆演變的追蹤

在白血病的診治過程中，由于受到各種因素包括自身及環(huán)境的影響，突變基因的類型、數(shù)量、位點(diǎn)是進(jìn)行著動態(tài)演變的，與病情的動態(tài)變化相關(guān)，對治療效果、預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)概率都有重要的指導(dǎo)意義[16]。目前發(fā)現(xiàn)的白血病克隆演變主要有以下幾種：①克隆基本不變的穩(wěn)定模式；②主克隆保持不變，亞克隆發(fā)生改變的線性演變模式；③主克隆與亞克隆共同發(fā)展變化的分支演變模式[17]?？寺⊙葑兊亩鄻有愿鷱?fù)雜性需要找到一種最適合的方法來進(jìn)行追蹤以指導(dǎo)臨床，利用NGS 進(jìn)行此類追蹤以其獨(dú)特的優(yōu)勢得到越來越多的認(rèn)同。

在NGS 出現(xiàn)前，測序的范圍有限，無法進(jìn)行大規(guī)模并行測序，在檢測患者基因時，常常只能有針對性地檢測原有的突變基因，卻忽略了初發(fā)時低于檢測閾值或后續(xù)新出現(xiàn)的突變基因[18]，以至于很多患者在復(fù)發(fā)后再次進(jìn)行全面的基因檢測才發(fā)現(xiàn)新的突變，這種情況下就會延誤治療。而NGS 的優(yōu)勢在于每次都可以進(jìn)行全面的基因檢測而不局限于原有的突變，靈敏度高，能及時發(fā)現(xiàn)新的突變，并結(jié)合該突變的意義協(xié)助評估病情。NGS 的推廣也讓白血病克隆演變的信息采集更為直觀，為后期治療方案提供可靠證據(jù)，也為臨床研究提供了更多寶貴的數(shù)據(jù)。

追蹤白血病克隆演變的重要目的是評估復(fù)發(fā)風(fēng)險[19]，及時調(diào)整治療方案。基因跟臨床的相關(guān)性給我們提供了思路，即有些基因跟白血病復(fù)發(fā)高度相關(guān)。2020 年發(fā)表于BLOOD 雜志的一項最新研究指出，兒童ALL 患者復(fù)發(fā)時伴隨多個常見的基因突變，如：NT5C2、CREBBP 等[20]。其可能初發(fā)即存在，也可能在后期才出現(xiàn)，及時發(fā)現(xiàn)這部分基因可以對患者白血病復(fù)發(fā)的概率做出前瞻性預(yù)測，并及時采取相應(yīng)策略防止復(fù)發(fā)?；诎籽?fù)發(fā)的危險性及NGS技術(shù)高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，對于病情危險度高，或治療效果不理想的患者，在有條件的前提下，建議利用NGS 定期進(jìn)行全面的基因檢測，追蹤克隆演變，以便及時發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的趨勢。

白血病治療過程中的難題之一是腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生耐藥性[21]，分子層面的機(jī)制往往是患者基因在環(huán)境與藥物等多種因素選擇下發(fā)生新的突變或亞克隆發(fā)展為主克隆，該突變對藥物不敏感而導(dǎo)致療效不佳。目前已發(fā)現(xiàn)有多種基因提示跟耐藥性相關(guān)，利用NGS 重點(diǎn)關(guān)注該類基因可以更快發(fā)現(xiàn)耐藥傾向。另外，利用NGS 發(fā)現(xiàn)患者各個階段的主克隆可以及時進(jìn)行靶向治療。目前白血病治療中，針對分子層面的靶向藥物已經(jīng)成為一個重要領(lǐng)域[22]，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個明確與白血病發(fā)病相關(guān)的基因時，可以針對其表達(dá)產(chǎn)物及下游因子研究抑制性藥物，治療效果常常優(yōu)于僅使用常規(guī)化療藥物。

4 總結(jié)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的深入，可以預(yù)測兒童白血病的研究與臨床診療必將越來越依賴于分子生物學(xué)手段。二代測序以其大規(guī)模并行測序的優(yōu)勢可以全面評估基因信息，給出臨床上的病情評估與治療方向，真正做到個體化、靈活性、可預(yù)測。二代測序面世后日趨成熟，但新的數(shù)據(jù)與信息也一直在對其進(jìn)行完善與補(bǔ)充。在未來的研究和臨床實(shí)踐中，臨床醫(yī)師要正確理解NGS 的意義和臨床應(yīng)用指征，使之能為更多的白血病患者服務(wù)。