四川省甘孜州藏綿羊梨形蟲感染情況的調(diào)查

藍 嵐，楊丹嬌，潘 瑤，吳建平，李友英，賀安祥，湯 承

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041 ； 2. 甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000 ； 3. 四川省肉牛創(chuàng)新團隊，四川 成都 610041)

四川省甘孜藏族自治州(簡稱甘孜州)位于青藏高原東南緣，是川西北生態(tài)示范區(qū)和國家生態(tài)屏障區(qū)。畜牧業(yè)是甘孜州基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)、傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，藏綿羊是甘孜州的優(yōu)勢和標志性物種之一，也是高原牧民重要的生產(chǎn)生活資料。梨形蟲病是一種蜱傳寄生蟲病[1]，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)廣泛分布[2]。梨形蟲可感染牛、羊、馬、犬、野生動物，其中部分蟲種如分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens,B.divergens)、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)和獵戶巴貝斯蟲(B.venatorum)還可以感染人[3-4]。梨形蟲病的典型臨床特征為發(fā)熱、溶血性貧血、血紅蛋白尿等，嚴重者可導(dǎo)致死亡[5]； 亞臨床感染可出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩、繁殖性能下降等，給畜牧業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失[6]。楊輔國等[7]、陳德明等[8]先后對甘孜州部分地方綿羊泰勒焦蟲病流行情況進行報道，此后再沒有其他相關(guān)報道。近年來，甘孜州養(yǎng)羊數(shù)量銳減，藏綿羊養(yǎng)殖數(shù)量已從2016年的104萬多頭減至2019年的46萬余頭，很多地方已不再養(yǎng)殖藏綿羊，選擇甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖的主要區(qū)域瀘定、丹巴等9個縣開展甘孜州藏綿羊梨形蟲感染情況調(diào)查，對今后甘孜州藏綿羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 血液樣本 本調(diào)查于2018年6月—2019年5月 采集甘孜州9個縣臨床健康羊全血352份，樣本信息如下：鄉(xiāng)城縣19份，瀘定縣43份，色達縣33份， 甘孜縣121份，得榮縣14份，丹巴縣30份，石渠縣32份，白玉縣30份，爐霍縣30份。

1.2 儀器設(shè)備 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購自Thermoforma公司；高速離心機，購自Eppendorf 公司；DYY-6型電泳儀，購自北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 全血總DNA提取 采用酚-氯仿法來進行全血總DNA的提取。

1.3.2 檢測方法 采用西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室建立的梨形蟲的巢式PCR方法進行檢測[9]。引物信息：外上游引物：5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′，外下游引物：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′，擴增片段大小為843 bp；內(nèi)上游引物：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′，內(nèi)下游引物：5′-GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC-3′，擴增片段大小為750 bp，靶基因為18S rRNA。反應(yīng)體系：第1輪反應(yīng)預(yù)混酶12.5 μL，外引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)， 第1輪樣本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。第2輪反應(yīng)預(yù)混酶12.5 μL,內(nèi)引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)，樣本DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：第1輪反應(yīng)94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。第2輪反應(yīng)95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。將第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 蟲種鑒定 從9個縣隨機挑選68份藏綿羊梨形蟲核酸陽性樣本PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到梨形蟲序列。通過NCBI上的BLAST比對，運用Lasergene 7.0 軟件對測得序列進行同源性分析，采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1 000)基于梨形蟲序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來鑒定梨形蟲蟲種。

1.4 檢測情況統(tǒng)計分析 對9個縣藏綿羊檢測情況統(tǒng)計，按照半農(nóng)半牧業(yè)縣(鄉(xiāng)城、瀘定、得榮、甘孜、丹巴、爐霍6個縣)和純牧業(yè)縣(色達、石渠、白玉3個 縣)來劃分進行結(jié)果匯總，用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 甘孜州藏綿羊梨形蟲的檢測 本試驗采集的352份藏綿羊全血樣本經(jīng)巢式 PCR擴增其18S rRNA部分基因序列，其中有147份樣本擴增出目的條帶(750 bp)，梨形蟲平均陽性率為41.76%，部分電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分藏綿羊梨形蟲巢氏PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of some nesed-PCR products of Tibetan sheep PiroplasmaM：DL 2 000 DNA 標準； 1～12：藏綿羊全血樣本；N：陰性對照； P：陽性對照M：DL 2 000 DNA marker； 1-12：Blood sample of Tibetan sheep；N：Negative control； P：Positive control

2.2 半農(nóng)半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲的檢測 甘孜州9個縣中半農(nóng)半牧業(yè)縣檢出梨形蟲核酸陽性樣本124份，平均陽性率為48.25%。純牧業(yè)縣檢出梨形蟲核酸陽性樣本23份，平均陽性率為24.21%，見表1。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，甘孜州半農(nóng)半牧縣藏綿羊梨形蟲感染率顯著高于純牧業(yè)縣(P<0.05)。

表1 甘孜州半農(nóng)半牧縣和純牧業(yè)縣藏綿羊梨形蟲檢測結(jié)果Table 1 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in the semi-agricultural and semi-pastoral counties and pure animal husbandry counties in Ganzi prefecture

2.3 甘孜州藏綿羊梨形蟲蟲種的鑒定 從甘孜州7個縣(除白玉縣和色達縣)的藏綿羊梨形蟲陽性樣本中隨機挑選68份樣本通過PCR產(chǎn)物測序鑒定蟲種。成功鑒定蟲種3個，其中呂氏泰勒蟲46份，陽性檢出率為67.65%；綿羊泰勒蟲14份，陽性檢出率為20.59%；奧氏巴貝斯蟲3份，陽性檢出率為4.41%。各縣梨形蟲蟲種情況見表2。

表2 甘孜州藏綿羊梨形蟲蟲種檢測結(jié)果Table 2 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in Ganzi prefecture

基于PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進行同源性比對分析并構(gòu)建進化樹鑒定藏綿羊梨形蟲蟲種。結(jié)果顯示，甘孜州藏綿羊感染的46株泰勒蟲序列與GenBank中呂氏泰勒蟲陜西株(MG930123)、緬甸株(LC326005)、貴州株(LC326005)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為呂氏泰勒蟲；感染的14株泰勒蟲序列與GenBank中綿羊泰勒蟲伊朗株(KX273858)、土耳其株(KT851438)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為綿羊泰勒蟲；感染的3株巴貝斯蟲序列與GenBank中奧氏巴貝斯蟲云南株(KY805843、KY805842、KY805840)聚為一大支且同源性>99%，鑒定為奧氏巴貝斯蟲。

2.4 甘孜州藏綿羊梨形蟲地域分布 甘孜州7個縣中藏綿羊呂氏泰勒蟲分布于瀘定縣、丹巴縣、鄉(xiāng)城縣、得榮縣、爐霍縣和甘孜縣，綿羊泰勒蟲分布于鄉(xiāng)城縣和石渠縣，奧氏巴貝斯蟲分布于鄉(xiāng)城縣。

3 討論

本試驗是首次對甘孜州州內(nèi)主要藏綿羊養(yǎng)殖的9個縣開展藏綿羊梨形蟲感染情況調(diào)查，藏綿羊梨形蟲平均陽性率達到41.76%，因采集樣本均為臨床健康樣本，說明甘孜州藏綿羊梨形蟲亞臨床感染嚴重。甘孜州半農(nóng)半牧業(yè)縣海拔較低、氣候適宜、植被種類多、牲畜流動大，適合蜱活動和繁殖，藏綿羊梨形蟲感染率顯著高于純牧業(yè)縣，試驗結(jié)果與胡廣衛(wèi)等[10]對青海羊泰勒蟲病流行情況調(diào)查結(jié)果一致，在一些農(nóng)區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)、林區(qū)的邊緣及有灌木林存在的地方羊泰勒蟲病常呈地方性流行。

本試驗共鑒定藏綿羊梨形蟲蟲種3個，其中呂氏泰勒蟲感染率為67.65%，為甘孜州優(yōu)勢蟲種；Zhang等[11]對甘肅省舟曲縣綿羊血液進行檢測發(fā)現(xiàn)舟曲縣呂氏泰勒蟲檢出率為67%；鐘維等[9]對采自四川阿壩州壤塘、小金、紅原縣的藏綿羊全血進行檢測，結(jié)果顯示，呂氏泰勒蟲陽性率為75.0%。綜上結(jié)果表明，呂氏泰勒蟲在青藏高原綿羊中廣泛分布。呂氏泰勒蟲為惡型泰勒蟲，泰勒蟲子孢子隨蜱蟲盯咬進入宿主體內(nèi)，以裂殖生殖的方式進行繁殖。在繁殖階段，裂殖體可引起淋巴細胞大量增殖，被感染的動物表現(xiàn)出貧血及不同水平的蟲血癥，嚴重者甚至造成宿主死亡[12-13]。本次試驗未對梨形蟲傳播媒介蜱的種類與分布進行調(diào)查，需要進一步進行調(diào)查研究，同時，由于感染情況較為嚴重，下一步有必要開展甘孜州藏綿羊梨形蟲病的防治工作。