超聲檢測(cè)技術(shù)在魚類人工繁殖的應(yīng)用價(jià)值分析

黃榮靜，孟 瑾 , 雷宇杰

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000 ； 2.河南省漁業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，河南 信陽(yáng) 464000)

超聲檢測(cè)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要應(yīng)用在鱘魚、大鯢和鯰科魚類等無(wú)鱗魚，多用于雌雄鑒定及內(nèi)臟疾病探查，多普勒超聲診斷技術(shù)在水產(chǎn)領(lǐng)域還需要更多基礎(chǔ)研究以便更好的發(fā)展應(yīng)用。本文選用黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、黃鱔(Monopterusalbus)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、泥鰍(Orientalweatherfish)、施氏鱘(Acipenserschrencki)和南方大口鯰(SilurussoldatovimeridionalisChen)共6種水生動(dòng)物作為試驗(yàn)對(duì)象，這6種水生動(dòng)物都是大宗特色水產(chǎn)品，屬于無(wú)鱗魚(施氏鱘有骨板)，均符合超聲檢測(cè)條件， 可用以探討超聲檢測(cè)的適用性；本試驗(yàn)還通過(guò)超聲檢測(cè)探查6種水生動(dòng)物在人工繁殖前不同月份中卵徑大小，比較人工繁殖時(shí)卵子發(fā)育的檢測(cè)符合率，為超聲檢測(cè)技術(shù)在水生動(dòng)物人工繁殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及管理 試驗(yàn)所用試驗(yàn)魚為雌性親魚，其中施氏鱘、斑點(diǎn)叉尾鮰和泥鰍親魚來(lái)源于正陽(yáng)縣匯龍水產(chǎn)有限公司；黃鱔和南方大口鯰親魚來(lái)源于羅山縣小龍山良種繁育場(chǎng)；黃顙魚親魚來(lái)源于黃石富爾水產(chǎn)苗種有限公司。各試驗(yàn)組親魚之間規(guī)格一致，年齡一致，各組親魚生物學(xué)指標(biāo)如表1。親魚管理歸各苗種繁育公司，本試驗(yàn)定期到各公司進(jìn)行超聲采樣。

表1 試驗(yàn)用親魚生物學(xué)指標(biāo)Table 1 Biological indexes of parent fish for experiment

1.2 主要儀器設(shè)備及工具 超聲診斷儀(意大利ESAOTE S.P.A)；魚用超聲診斷床(自制工具，授權(quán)專利號(hào)為：ZL201621217228.7)。醫(yī)用超聲耦合劑(天津市西苑寺制作所)；催產(chǎn)藥物：垂體(PG)、絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素(LRHA)等。

1.3 超聲操作方法 根據(jù)魚種卵巢發(fā)育和成熟時(shí)期的不同，每種水生動(dòng)物的采樣時(shí)間并不一致，測(cè)量卵徑的時(shí)間主要集中于3～8月份。將魚用擔(dān)架放在魚用超聲診斷床上并在合適的位置卡好，將試驗(yàn)對(duì)象引入擔(dān)架中，腹面朝上，控制好擔(dān)架的寬度，放置在魚用擔(dān)架上，需1～2名操作人員穩(wěn)定住魚體。待試驗(yàn)魚安靜不掙扎時(shí)，在試驗(yàn)對(duì)象腹部涂上耦合劑，使用矩形探頭(頻率為3～5 mHz)，緊貼魚體腹部從肛門開始向上探測(cè)，找出卵巢位置并進(jìn)行探測(cè)，從影像中選取影像清晰的卵子，測(cè)量其直徑，然后迅速放回親魚池內(nèi)。其中每條魚卵母細(xì)胞測(cè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)種類不同月份卵母細(xì)胞大小取其均值。

1.4 人工繁殖操作方法 人工繁殖技術(shù)視不同水生動(dòng)物，其催產(chǎn)時(shí)間、催產(chǎn)藥物及劑量、催產(chǎn)效應(yīng)時(shí)間不同。當(dāng)親魚開始排卵時(shí)，每條親魚收集10枚游離的卵子于Bouln液或中性福爾馬林液中固定24～48 h，再在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量，每條魚游離卵子測(cè)4個(gè) 重復(fù)，每個(gè)種類取其均值。在收集卵子過(guò)程中一定要快而準(zhǔn)，防止卵子干癟，也不能放入水中因吸水膨脹而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)于測(cè)得的卵徑，采用SPSS 20.0分析軟件和EXCEL對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 超聲技術(shù)對(duì)6種水生動(dòng)物卵子不同發(fā)育階段的檢測(cè) 超聲測(cè)量主要集中在卵巢發(fā)育3～8月份，根據(jù)魚種卵巢發(fā)育和成熟時(shí)期的不同，每種水生動(dòng)物的采樣時(shí)間不一致，主要測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

黃顙魚卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，7月份的卵徑與3～5月份的卵徑大小差異顯著(P<0.05)，超聲探測(cè)可見(jiàn)高回聲的卵粒，卵粒大小比較均勻，卵徑均值在(1.72±0.06)mm，按壓腹部，超聲可見(jiàn)卵粒的移動(dòng)，可斷定7月份的超聲影像與生理學(xué)上黃顙魚的卵母細(xì)胞處于Ⅴ期一致[1]；3～5月份超聲探查可見(jiàn)卵粒，但是卵粒比較致密，按壓腹部，超聲影像不見(jiàn)卵粒游離，可斷定3～5月份超聲影像與黃顙魚第Ⅳ時(shí)相的卵母細(xì)胞發(fā)育一致。

黃鱔卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，3～5月份卵徑與6月份卵徑大小差異顯著(P<0.05)。在3～5月份超聲檢測(cè)中，可以清晰探測(cè)到卵粒，卵粒大小不一，且由于細(xì)胞之間的擠壓，在超聲檢測(cè)下此時(shí)的卵母細(xì)胞形態(tài)也不一，輕壓腹部，卵子致密，超聲影像檢測(cè)不到其游動(dòng)，可以斷定此階段的超聲探查從形態(tài)和大小上與黃鱔第Ⅳ時(shí)相的卵母細(xì)胞發(fā)育一致；6月份 超聲檢測(cè)黃鱔卵巢，在超聲探頭的探查段，都可檢測(cè)到卵圓形的卵粒，其卵徑大小為(3.35±0.08)mm，輕壓腹部，超聲影像可觀測(cè)到卵子在卵巢內(nèi)的游動(dòng)，可斷定此階段為成熟的第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞[2]。

斑點(diǎn)叉尾鮰卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，7月份的卵徑大小與4～6月份差異顯著(P<0.05)。在超聲檢測(cè)下，7月份的單個(gè)卵母細(xì)胞超聲為高回聲，可見(jiàn)游離的卵圓形卵母細(xì)胞，卵徑大小為(2.63±0.03)mm；4～6月份超聲探查，超聲可見(jiàn)卵粒回聲，卵粒大小不一致較多，擠壓腹部，超聲顯示卵粒不具備流動(dòng)性，可定4～6月份卵母細(xì)胞為第Ⅳ時(shí)相的卵母細(xì)胞[3]。

表2 超聲技術(shù)對(duì)不同月份下卵徑大小探測(cè)Table 2 Ultrasonic detection of egg diameter in different months

泥鰍卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，隨著卵母細(xì)胞的成熟，其3～6月份卵徑大小差異不顯著(P>0.05)，與泥鰍個(gè)體小、懷卵量大有很大關(guān)系。通過(guò)超聲檢測(cè)，3～5月份卵粒經(jīng)腹部擠壓，卵粒不游離；6月份超聲檢測(cè)的卵粒經(jīng)腹部擠壓，超聲影像可見(jiàn)卵粒的流動(dòng)[4]。泥鰍的成熟卵子可通過(guò)超聲影像下卵粒是否具有游動(dòng)性判定。

施氏鱘卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，7～8月份卵徑大小與4～6月份差異顯著(P<0.05)。在超聲檢測(cè)下，8月份施氏鱘雙側(cè)卵巢中，卵粒在超聲卵徑為(3.88±0.03)mm，且超聲下按壓腹部，卵母細(xì)胞具有游動(dòng)性；7月份卵徑雖與8月份差異不顯著，但是此期的卵母細(xì)胞尚未完全成熟，按壓腹部時(shí)超聲顯示卵粒之間無(wú)游動(dòng)性；4～6月份超聲檢測(cè)下，卵粒之間無(wú)游動(dòng)，卵粒大小不一[5-7]。

南方大口鯰卵母細(xì)胞在超聲檢測(cè)下，7月份排卵前可測(cè)卵徑為(1.79±0.04)mm，擠壓腹部，超聲影像顯示卵母細(xì)胞在卵巢腔內(nèi)的游動(dòng)，其他月份卵徑大小可測(cè)，但影像不顯示其游動(dòng)，說(shuō)明卵母細(xì)胞尚未發(fā)育成熟，卵粒致密，黏附性大[8]。

2.2 催產(chǎn)前卵子超聲檢測(cè)與催產(chǎn)排卵后卵子顯微鏡檢測(cè)對(duì)比 把6種水產(chǎn)動(dòng)物催產(chǎn)前超聲檢測(cè)卵子的大小與催產(chǎn)排卵后卵子大小進(jìn)行比較，見(jiàn)表3。由表3可知，催產(chǎn)前后其測(cè)得的卵徑均值相近，對(duì)比每種魚的2組數(shù)據(jù)，黃顙魚超聲檢測(cè)卵徑的符合率在99.42%，黃鱔超聲檢測(cè)卵徑符合率在99.11%，斑點(diǎn)叉尾鮰超聲檢測(cè)卵徑的符合率在99.62%，泥鰍超聲檢測(cè)卵徑符合率在99.36%，施氏鱘超聲檢測(cè)卵徑的符合率在99.48%，南方大口鯰超聲檢測(cè)卵徑的符合率在98.90%。6種魚類利用超聲檢測(cè)排卵時(shí)卵徑的大小的符合率均在98.9%以上。

表3 催產(chǎn)前卵子超聲檢測(cè)與催產(chǎn)排卵后卵子顯微鏡檢測(cè)Table 3 Ultrasound examination of eggs before and after ovulation

3 討論

在人類醫(yī)學(xué)上，超聲檢測(cè)技術(shù)因具有檢測(cè)效率高，檢測(cè)過(guò)程無(wú)痛苦，檢測(cè)結(jié)果精確等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用；在畜牧上，隨著集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，為提高檢測(cè)效率，減少動(dòng)物痛苦，超聲診斷技術(shù)在畜禽動(dòng)物的應(yīng)用越來(lái)越多；超聲技術(shù)在水產(chǎn)應(yīng)用有其一定的局限性，主要原因是聲波具有較特殊的物理性質(zhì)，在檢測(cè)時(shí)魚類鱗片會(huì)吸收部分超聲波，這就對(duì)超聲成像造成了直接的影響，易形成偽像。超聲診斷技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖的相關(guān)研究較少，主要應(yīng)用在魚的心臟超聲成像研究[9]、無(wú)鱗魚的臟器超聲成像研究[10-11]、利用超聲鑒別雌雄魚[12]以及利用超聲技術(shù)診斷疾病[13]等方面。親魚人工繁殖是水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)極其重要的一個(gè)領(lǐng)域，決定了水產(chǎn)行業(yè)持續(xù)發(fā)展，對(duì)親魚進(jìn)行保護(hù)和隨期診斷如同對(duì)孕婦進(jìn)行周期檢查一樣重要，很多繁育場(chǎng)對(duì)親魚卵子的診斷多采用挖卵器取卵，對(duì)魚體會(huì)造成一定傷害，超聲技術(shù)作為不傷害魚體的直接檢測(cè)，對(duì)親魚隨期診斷極其重要。

本試驗(yàn)利用超聲檢測(cè)技術(shù)，旨在探究其是否可以作為輔助魚類人工繁殖卵子發(fā)育情況的檢測(cè)工具。在試驗(yàn)之初，僅考慮通過(guò)卵徑大小作為評(píng)判發(fā)育成熟的一種指標(biāo)，但在試驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)不同月份的超聲觀察，卵粒在超聲影像中是否具有游動(dòng)性也可作為評(píng)判卵子成熟和是否達(dá)到催產(chǎn)的一種指標(biāo)，通過(guò)這2個(gè)指標(biāo)再結(jié)合繁殖生理期反應(yīng)，為親魚人工繁殖提供可靠的技術(shù)支撐。通過(guò)不同時(shí)期對(duì)超聲檢測(cè)，積累了6種魚的卵子成熟期卵徑大小，其中黃顙魚成熟期卵徑為(1.72±0.06)mm，黃鱔成熟期卵徑為(3.35±0.08)mm，斑點(diǎn)叉尾鮰成熟期卵徑為(2.63±0.03)mm，泥鰍成熟期卵徑為(1.57±0.06)mm，施氏鱘成熟期卵徑為(3.88±0.03)mm，南方大口鯰成熟期卵徑為(1.79±0.04)mm；通過(guò)排卵檢測(cè)，超聲檢測(cè)與實(shí)際排卵卵徑符合率均達(dá)到98.90%以上，超聲檢測(cè)卵徑科學(xué)、精確。綜上所述：對(duì)于無(wú)鱗魚或珍稀魚類應(yīng)用超聲檢測(cè)卵巢發(fā)育，其分辨率和診斷符合率比較高，可作為人工繁殖診斷卵子發(fā)育情況的首選方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。