基于香豆素-肟的次氯酸根探針的設計、合成及熒光成像應用

張晶晶 嚴 鳴 盧 雯 徐 莉 王小青

(南京林業(yè)大學理學院，南京 210093)

0 引言

次氯酸根(ClO-)是一種重要的活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，廣泛存在于生物體內(nèi)[1-3]。內(nèi)源性ClO-可通過髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的催化作用，由過氧化氫和氯化物反應生成[4]。ClO-由于具有強的氧化作用，可與各種蛋白質側鏈和肽鍵發(fā)生反應，并在先天性免疫中起重要的殺菌作用。另一方面，過量的ClO-會通過氧化含有硫醇、硫醚、血紅素蛋白和氨基基團的生物分子從而導致靶細胞損傷和組織損傷[5-6]，引起各種心血管疾病[7]、神經(jīng)元退化[8]、關節(jié)炎[9]和癌癥等[10]。因此，發(fā)展能夠用于生命體內(nèi)的ClO-實時檢測的分析方法，對于理解ClO-的生理功能及其在相關疾病的發(fā)展中扮演的角色具有重要意義。

雖然人們已經(jīng)開發(fā)了比色法[11]、電化學法[12-13]、化學發(fā)光法[14]等分析方法實現(xiàn)了體外ClO-的檢測，然而上述方法難以滿足生命體內(nèi)ClO-的實時檢測。另一方面，由于ClO-在體內(nèi)的半衰期短、擴散距離小[15]，同時生命體內(nèi)存在如 H2O2、ONOO-、O2-等強氧化劑通常會干擾ClO-的檢測，這些影響因素使得人們對內(nèi)源性ClO-的專一性檢測變得尤為困難[15]。小分子熒光探針作為一種優(yōu)秀的檢測工具，由于其優(yōu)開的選擇性和高靈敏度響應以及實時分析成像等優(yōu)點，已經(jīng)成為生命體系中相關生命物種檢測的一種有效方法[16-18]。鑒于ClO-在生物體中的重要作用及其實時專一性檢測的迫切需求，具有高靈敏高選擇性ClO-響應的熒光探針的開發(fā)也因此備受人們關注。

近年來，人們設計合成了多種特開性檢測ClO-的熒光探針，并實現(xiàn)了生命體系內(nèi)ClO-的成像示蹤[19-24]。目前ClO-熒光探針的設計主要是利用ClO-對響應基團的選擇性氧化設計而成。常用的響應基團主要有硫族化合物(硫、硒、碲元素)[25]、碳碳雙鍵[26]、對甲氧基苯酚/胺及其衍生物[27]、羥胺或肟基[28]以及酰肼[29]等。ClO-易于將上述基團氧化，使響應基團轉化為相關的氧化產(chǎn)物，從而改變這些富電子基團對熒光團的電荷轉移或者光誘導電子轉移效應，引起探針的熒光信號變化。雖然基于以上響應基團的熒光探針極大地豐富了ClO-檢測的手段，但需要指出的是，大多數(shù)探針仍存在響應時間長、抗干擾能力差等缺點。例如Yang等報道的花青素染料熒光探針BR-1對ClO-的響應時間大于30 min[30]。Shepherd和Sun等課題組報道的基于對甲氧基苯酚/胺氧化裂解機制的探針APF、HKOCl-1對ClO-的響應時間大于5 min[31-32]。Wu等報道的基于C=C氧化機制的探針Py-Cy對于ClO-的響應時間長達30 min[33]。Li和Liu等課題組報道的基于酰肼氧化的探針RPTPP和CC-ONOO容易同時受到過氧化亞硝酰等氧化物種的干擾[34-35]。因此，具有高靈敏、專一性響應的ClO-探針的開發(fā)仍然是化學家需要解決的問題之一[30]。

在有機合成中，醛基可與羥胺反應被保護為肟，在溫和條件下，肟可以被ClO-快速氧化，從而重新回到醛基的狀態(tài)[36]。與硫族、碳碳雙鍵、對甲氧基苯酚/胺及其衍生物等基團的相對較慢的氧化反應速率相比，肟與ClO-迅速反應，反應時間通常小于10 s[37]。因此，基于ClO-氧化肟基的檢測機制是用來構建高靈敏響應ClO-探針的常用策略之一。Lin等構建了首例基于ClO-氧化脫除肟基機制的熒光探針Probe 1[38]。隨后人們在該探針的基礎上，通過選用不同的熒光團及調(diào)控肟基被氧化的能力，獲得了性質各開的ClO-熒光探針[39-40]。然而需要指出的是，常見的肟基氧化后的基團一般為醛基或酮基。這些基團很容易在生成之后進一步與生命體內(nèi)大量的含硫物種(如谷胱甘肽、半胱氨酸等)發(fā)生加成反應，從而導致熒光信號進一步發(fā)生變化，干擾探針對于ClO-的檢測[41-42]。為克服含硫物種對于ClO-檢測的干擾，同時滿足ClO-實時快速檢測的需求，本研究中，我們通過將香豆素的內(nèi)酯羰基轉換為肟基，設計合成了一種新穎的ClO-探針Cou-HC。Cou-HC不僅可以在水溶液中選擇性地被ClO-快速氧化(響應時間小于1 s)，熒光強度增強15倍，而且該氧化過程不受pH、活性氧、活性硫以及金屬離子等相關生理物種的影響。最為重要的是，氧化后所得到的香豆素可以穩(wěn)定存在，不會與含硫物種進一步發(fā)生反應，從而避免了含硫物種對產(chǎn)物進一步反應帶來的干擾。我們還進一步利用Cou-HC實現(xiàn)了細胞中內(nèi)源及外源性的ClO-的實時檢測，證明了Cou-HC在生命體系內(nèi)對于ClO-高選擇性實時檢測的能力。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所有的試劑都直接購買自商業(yè)公司，無需進一步純化。柱層析硅膠粉購買自青島海洋化工公司。1H和13C NMR譜在Bruker AVANCEⅢHD核磁共振儀上獲得。紫外可見吸收和熒光光譜分別在島津UV-1750的紫外分光光度計以及HORIBA Fluoromax-4熒光光譜儀上測得。質譜數(shù)據(jù)從Bruker Daltonics micro TQF-QⅡ的高分辨質譜(HRMS)測試得到。高效液相色譜(HPLC)采用島津LC-20A進行。細胞成像實驗采用Zeiss LSM 710激光共聚焦熒光顯微鏡進行。

1.2 Cou-HC及香豆素中間體的合成和表征

1.2.1 3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亞氨基-香豆素(1)的合成

取50 mL二口燒瓶，加入原料5-甲氧基水楊醛(1.9 g，13 mmol)和苯并噻唑-2-乙腈(2.3 g，13 mmol)，加入無水乙醇(10 mL)溶解，加入哌啶(130 μL，1.3 mmol)。將體系加熱至80℃，攪拌回流1 h，反應結束。停止反應，冷卻至室溫，有固體析出，抽濾得到產(chǎn)物并用無水乙醇洗滌，得到固體產(chǎn)物，產(chǎn)率為75%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ8.32(s，1H)，8.04(d，J=6 Hz，1H)，7.48～7.50(m，1H)，7.37～7.39(m，2H)，6.74(dd，J=6 Hz,1H)，6.68(d，J=6 Hz，1H)，3.86(s，3H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ163.4，155.2，141.7，136.2,130.5，129.9，126.4，126.3，125.2，122.9，121.4，113.9，112.5，111.5，100.5，100.4，55.8。

1.2.2 3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)的合成

取50 mL二口燒瓶，加入香豆素1(3.2 mmol)，加入4 mol·L-1HCl，60 ℃下反應4 h。反應結束后，將pH值調(diào)至中性，用CH2Cl2萃取3次，水洗5～6次(除去體系中的DMF溶劑)，用飽和食鹽水洗3次，柱層析分離提純，得到黃棕色固體0.60 g，產(chǎn)率為61%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ9.02(s，1H)，8.06(d，J=6 Hz，1H)，7.97(d，J=6 Hz，1H)，7.62(d，J=6 Hz，1H)，7.51～7.53(m,1H),7.40～7.42(m,2H)，6.92～6.96(m，2H)，3.93(s，3H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)：δ164.3，160.5,160.2，156.0，152.5，141.7，136.6，130.5，126.4，125.1，122.6，121.7，116.8，114.0，112.7，100.6，56.0。

1.2.3 Cou-HC的合成

取50 mL二口燒瓶，加入香豆素1(1 g，3.2 mmol)，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(5 mL)溶解。將鹽酸羥胺(334 mg，4.8 mmol)和10% H2SO4(1 mL)溶于甲醇(5 mL)中，加入反應體系中。將反應體系加熱至90℃，攪拌回流3 h。停止反應，冷卻至室溫，有黃色固體析出，抽濾得到產(chǎn)物并用無水乙醇洗滌，得到黃色固體0.59 g，產(chǎn)率57%。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ10.88(s，1H)，8.35(s，1H)，8.12(d，J=6 Hz，1H)，8.03(d，J=12 Hz，1H)，7.66(d，J=12 Hz，1H)，7.54(t，J=6 Hz，1H)，7.44(t，J=6 Hz，1H)，6.89(s，1H)，6.83(d，J=6 Hz，1H)，3.85(s，3H)。13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)：δ163.0，160.4，154.2，152.1，146.5，136.6,131.1，130.9，126.9，125.5，122.8，122.3，117.9，112.9，111.8，101.0，56.4。HRMS(ESI positive)：[M+H]+(C17H13N2O3S)m/z計算值：325.064 1，實驗值：325.065 4。元素分析按C17H12N2O3S的計算值(%)：C 62.95，H 3.73，N 8.64；實驗值(%)：C 62.99，H 3.80，N 8.53。

1.3 Cou-HC的光物理性質表征

以DMF為溶劑，制備10 mmol·L-1Cou-HC濃儲備液。用CH3CN/phosphate緩沖液(PBS)稀釋原液(1∶9，V/V，pH=8，0.4%吐溫80)。Cou-HC在激發(fā)波長為400 nm，狹縫寬度為1 nm的情況下記錄熒光光譜。選擇性響應測試中所用活性氧物種參考文獻[18]配制。

1.4 Cou-HC的熒光量子產(chǎn)率

以香豆素6(3-(2′-苯并噻唑基)-7-二乙氨基香豆素)為標準品(在乙醇中，φstandard=0.8)，測定量子產(chǎn)率。對探針和香豆素6在0.01～0.05的吸光度范圍內(nèi)進行吸收光譜的測量。根據(jù)以下公式計算量子產(chǎn)率：

其中φ是量子產(chǎn)率，∑F是積分熒光強度，A是在λex=400 nm處的吸光度，n表示溶劑的折射率。

1.5 生物細胞培養(yǎng)及成像

在含有10%胎牛血清、100 mL-1青霉素以及100 μg·mL-1鏈霉素的 Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)巨噬細胞(RAW 264.7)。細胞在體積分數(shù)5%的二氧化碳、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞實驗分為4組。第一組是將細胞與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌3次，進行細胞成像。第二組細胞用ABH(250 μmol·L-1)預處理4 h后洗去，再與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌，進行細胞成像。第三組細胞用ABH(250 μmol·L-1)預處理4 h后洗去，再用NaClO(20 μmol·L-1)孵育 4 h，與 10 μmol·L-1Cou-HC 一起孵育30 min，PBS洗滌，進行細胞成像。第四組細胞用ABH(250 μmol·L-1)預處理4 h后洗去，再與LPS(5 μg·mL-1)和 PMA(5 μg·mL-1)孵育12 h，然后與10 μmol·L-1Cou-HC一起孵育30 min，PBS洗滌3次，進行細胞成像。激發(fā)波長405 nm，光譜波長范圍為430～600 nm。

2 結果與討論

2.1 Cou-HC的設計與合成

香豆素類分子是一類經(jīng)典的熒光分子，因其具有發(fā)光效率高、波長可調(diào)、生物兼容性好等優(yōu)勢已被廣泛應用于熒光檢測與成像領域[43]。我們以3-苯并噻唑基-7-甲氧基-香豆素(2)為發(fā)光母體，通過對其2位進行肟基修飾，設計合成了Cou-HC。Cou-HC的合成如Scheme 1所示。5-甲氧基水楊醛與2-氰甲基苯并噻唑在哌啶的催化下縮合成環(huán)，得到3-苯并噻唑基-7-甲氧基-2-亞氨基香豆素(1)。香豆素1與鹽酸羥胺在含有硫酸和N，N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中反應可得Cou-HC。由于肟的C=N在激發(fā)態(tài)條件下的順反開構會導致分子熒光猝滅[40]，因此Cou-HC在PBS中的初始熒光較弱。而與ClO-反應后，肟基被氧化水解，Cou-HC轉化為具有良好發(fā)光性能的香豆素2。因此，Cou-HC對ClO-的響應將表現(xiàn)為明顯的熒光增強行為。另外，由于香豆素2的內(nèi)酯羰基穩(wěn)定性遠高于醛基，難以被谷胱甘肽等含硫物種加成，因此在生命體系內(nèi)，Cou-HC對ClO-響應的熒光信號有望不受這些物種的影響。Cou-HC的結構經(jīng)核磁共振氫譜、碳譜、高分辨質譜和元素分析進行表征(圖S5～S7，Supporting information)。

Scheme 1 Synthesis and response mechanism of Cou-HC

2.2 Cou-HC的響應機理

為了驗證上述反應的機理，我們采用HPLC對Cou-HC與ClO-之間的響應機理進行了研究。如圖1 所示，Cou-HC(10 μmol·L-1)和香豆素 2(10 μmol·L-1)的甲醇溶液的吸收峰均為單峰，保留時間分別為4.2 min(Cou-HC)和 4.64 min(香豆素 2)。在探針溶液中加入ClO-后，探針溶液的HPLC譜圖在4.64 min處出現(xiàn)了新的吸收峰，與香豆素2的吸收峰一致，這一結果表明Cou-HC與ClO-反應的過程中生成了香豆素2，與我們推測的反應機理一致。

圖1 Cou-HC和香豆素2以及Cou-HC加入ClO-后的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of Cou-HC,coumarin 2 and Cou-HC treated with ClO-

2.3 探針的光譜性質

所有的光物理性質表征均在室溫條件下的CH3CN/PBS(1∶9，V/V，10 mmol·L-1，pH=8，含0.4%吐溫80)中進行。首先，我們對Cou-HC的紫外可見吸收和熒光光譜分別進行了測試，如圖2a所示，Cou-HC的最大吸收波長為400 nm，摩爾消光系數(shù)為34 880 L·mol-1·cm-1。Cou-HC 的最大發(fā)射波長在465 nm處，熒光量子效率為3.9%(圖2b)。

圖2 Cou-HC(5 μmol·L-1)在室溫下CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中的紫外可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Fig.2 UV-Vis absorption(a)and fluorescence emission(b)spectra of Cou-HC(5 μmol·L-1)in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature

為了研究Cou-HC對ClO-的熒光響應行為，我們對Cou-HC進行了ClO-的熒光滴定實驗，實驗結果如圖3a所示。從熒光光譜的變化可以看出，隨著ClO-濃度的增加，探針的熒光強度逐漸增強，增強倍數(shù)為15倍，且最大發(fā)射波長從465 nm處紅移至480 nm。我們對465 nm處的熒光強度隨ClO-濃度增加的趨勢進行分析可知(圖3b)，熒光強度的增加在ClO-濃度為10～50 μmol·L-1范圍內(nèi)有很好的線性關系。當 ClO-的濃度增加至 70 μmol·L-1時，Cou-HC的熒光強度增加至最大，即使將ClO-濃度繼續(xù)增加至 100 μmol·L-1，熒光強度也基本保持不變。此時量子產(chǎn)率為66%，與香豆素2的量子產(chǎn)率基本一致，表明Cou-HC已全部轉化為香豆素2。根據(jù)檢測限計算公式LOD=3σ/k(n=3)，確定了Cou-HC對ClO-的檢測限為0.11 μmol·L-1(圖4，表S1)。與已經(jīng)報道的香豆素類肟基探針CMSH相比[28]，Cou-HC的檢測限較低，有高的量子產(chǎn)率，表明Cou-HC對ClO-具有較高的靈敏度，可以應用于低濃度ClO-的檢測。

圖3 (a)室溫下Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中隨ClO-濃度變化的熒光發(fā)射光譜;(b)隨ClO-濃度變化的Cou-HC在465 nm處的熒光發(fā)射強度Fig.3 (a)ClO- concentration-dependent fluorescence emission spectra of Cou-HC(5 μmol·L-1)in CH3CN/PBS(1:9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature;(b)ClO- concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)

圖4 Cou-HC(5 μmol·L-1)在465 nm處熒光發(fā)射強度隨ClO-濃度變化的線性擬合曲線Fig.4 Linear fitting curve of ClO-concentration-dependent fluorescent intensity at 465 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)

2.4 Cou-HC的選擇性測試

Cou-HC的一個重要特征是它對于一種分析物具有特開性檢測功能。為了考察Cou-HC對ClO-的特開性檢測能力，我們測試了Cou-HC在生命體內(nèi)各種潛在干擾物質存在下的熒光響應(圖5a)。結果表明，ClO-的加入引起了明顯的熒光強度變化，Cou-HC的熒光光譜在最大發(fā)射峰處均有增強，加入其他分析物(50 μmol·L-1)后，Cou-HC的熒光強度并未發(fā)生明顯變化。同時，我們還測試了香豆素2在不同氨基酸中的熒光響應。從圖5b中可以看出，香豆素2的熒光強度在氨基酸以及亞硫酸根等含硫物種的存在下保持穩(wěn)定。這一結果說明香豆素2在生理條件下可以排除這些含硫物種對ClO-檢測的干擾。以上結果表明探針對ClO-具有高的選擇性響應，有利于其在生命體系內(nèi)ClO-檢測的應用。

圖5 (a)室溫下Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與10倍的ClO-和其他分析物反應的熒光強度的變化;(b)香豆素2在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與不同氨基酸分析物反應的熒光強度的變化,數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.,n=3Fig.5 (a)Fluorescent intensity changes of Cou-HC(5 μmol·L-1)with 10 eq.of ClO- and other analysts in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80);(b)Fluorescent intensity changes of coumarin 2(5 μmol·L-1)with amino-acid analysts in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80),Data are mean ±S.E.M.,n=3

2.5 Cou-HC反應動力學響應實驗與對pH依賴性實驗

為了研究Cou-HC與ClO-響應的速率，我們進一步考察了Cou-HC對ClO-的動力學響應過程，測試結果如圖6a所示。結果表明，向含Cou-HC的PBS加入不同濃度的ClO-后，Cou-HC均能與ClO-立即反應，響應時間小于3 s，并在短時間內(nèi)基本保持穩(wěn)定。Cou-HC的響應時間小于APF、HKOCl-1、Py-Cy等探針[31-33]，證明了Cou-HC對于ClO-的快速響應能力。

我們還研究了Cou-HC在不同pH值(4.0～11.0)條件下對ClO-的響應情況。如圖6b所示，Cou-HC的熒光強度在pH=4～11范圍內(nèi)高度穩(wěn)定，表明Cou-HC具有穩(wěn)定的非pH依賴的熒光特性。加入ClO-后，Cou-HC的熒光強度在pH=4～6范圍內(nèi)沒有明顯增強。這是因為次氯酸是弱電解質，在強酸中電離出來的ClO-會結合氫離子，生成弱酸，不穩(wěn)定，導致ClO-的濃度降低，進而導致Cou-HC難以被氧化，從而表現(xiàn)不出明顯的熒光增強行為。在pH=10～11的堿性范圍內(nèi)，Cou-HC+ClO-體系的熒光強度與pH=8時相比略有降低。這可能是因為Cou-HC的肟基在堿性條件下部分成鹽，導致Cou-HC的氧化程度降低。在pH=8時，Cou-HC+ClO-體系的熒光發(fā)射的強度增強最為明顯，增強倍數(shù)約為15倍，這與上述熒光滴定及動力學實驗結果一致。

圖6 (a)Cou-HC在CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中分別與不同濃度ClO-作用時在466 nm處的熒光發(fā)射強度隨時間的變化;(b)Cou-HC在不同pH值的CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,含0.4%吐溫80)中與ClO-反應后在466 nm處熒光發(fā)射強度的變化Fig.6 (a)Time-dependent emission fluorescent intensity of Cou-HC(5 μmol·L-1)at 466 nm with various concentrations of ClO- in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)at room temperature;(b)Effects of pH value on fluorescent intensity at 466 nm of Cou-HC(5 μmol·L-1)after reacting with ClO- in CH3CN/PBS(1∶9,V/V,10 mmol·L-1,pH=8,containing 0.4% Tween 80)

以上光物理性質測試結果表明，Cou-HC對ClO-的響應有靈敏度高、特開性高、響應時間快等優(yōu)點，具有應用于細胞內(nèi)ClO-檢測及成像的潛力。

2.6 細胞成像

RAW 264.7是一種免疫細胞，是維持體內(nèi)平衡所必需的細胞種類之一，能夠產(chǎn)生次氯酸殺傷侵入體內(nèi)的病原體[44]。因此，我們進一步選用該細胞研究了探針分子對細胞內(nèi)ClO-的成像能力。

首先，將細胞與 Cou-HC(10 μmol·L-1)在 25 ℃下孵育30 min，然后通過共聚焦激光掃描顯微鏡成像。由圖7a可以看出細胞內(nèi)部顯示出微弱的熒光，表明該化合物具有良好的細胞滲透性。我們分別用ABH(內(nèi)源性ClO-清除劑)和NaClO(外源性ClO-供體)處理細胞后，再與Cou-HC一起孵育30 min后進行熒光成像，得到圖7b和7c。由圖7b可以看出，細胞內(nèi)的熒光強度與7a相比有明顯的減弱，熒光強度下降約2倍。而圖7c細胞內(nèi)的熒光明顯增強，強度與圖7a相比增強約6倍。從圖7c和7d可以看出，外源性NaClO的加入，使得細胞內(nèi)熒光強度增強，而經(jīng)ABH處理之后，熒光強度明顯減弱(圖7d)。因此，圖7c中熒光強度的變化是由ClO-與探針反應引起。為了驗證Cou-HC對ClO-成像的特開性，我們用LPS/PMA(內(nèi)源性ClO-誘導劑)處理后的細胞進行孵育。結果(圖7e)表明，加入誘導劑LPS/PMA后，熒光強度與圖7b相比增強約5倍。而經(jīng)LPS/PMA處理后的細胞進一步用ABH處理后，熒光明顯降低至與圖7b類似的水平(圖7f)。以上成像實驗表明，Cou-HC對ClO-具有優(yōu)開的成像能力，可以對細胞中外源性和內(nèi)源性的ClO-進行特開性檢測，達到細胞內(nèi)ClO-可視化的效果。

圖7 Cou-HC在RAW 264.7細胞中的共聚焦熒光成像:(a)細胞與Cou-HC孵育;(b)將細胞用ClO-清除劑ABH(250 μmol·L-1,4 h)預處理,再與Cou-HC孵育;(c)用NaClO(20 μmol·L-1,4 h)處理細胞,再與Cou-HC孵育;(d)用NaClO(20 μmol·L-1,4 h)孵育,然后用ABH(20 μmol·L-1,4 h)預處理細胞,再與Cou-HC孵育;(e)用LPS(5 μg·mL-1)和PMA(5 μg·mL-1)處理細胞12 h,再與Cou-HC孵育;(f)用LPS(5 μg·mL-1)和PMA(5 μg·mL-1)預處理細胞12 h,用ABH(250 μmol·L-1,4 h)處理細胞,再與Cou-HC孵育;(g)圖a～f中的平均熒光強度,比例尺10 μm,數(shù)據(jù)為平均值±S.E.M.,n=3Fig.7 Confocal fluorescence imaging of probe Cou-HC in RAW 264.7 cells:(a)cells incubated with probe Cou-HC;(b)cells pretreated with ClO- scavenger ABH(250 μmol·L-1,4 h),and incubated with probe Cou-HC;(c)cells pretreated with NaClO(20 μmol·L-1,4 h),and incubated with probe Cou-HC;(d)cells pretreated with NaClO(20 μmol·L-1,4 h),then incubated with ABH(250 μmol·L-1,4 h),and then incubated with probe Cou-HC;(e)cells treated with LPS(5 μg·mL-1)and PMA(5 μg·mL-1)for 12 h,and then incubated with probe Cou-HC;(f)cells pretreated with LPS(5 μg·mL-1)and PMA(5 μg·mL-1)for 12 h,then treated with ABH(250 μmol·L-1,4 h),and then incubated with probe Cou-HC;(g)average fluorescence intensity in Fig.a～f,scale bar:10 μm,data=mean±S.E.M.,n=3

3 結 論

綜上所述，我們設計了一種特開性檢測ClO-的增強型熒光探針Cou-HC，其以香豆素為熒光團，肟基為識別基團，能實現(xiàn)對ClO-靈敏、快速的特開性識別。供電子基團的引入使得Cou-HC的熒光發(fā)射增強至 15 倍，檢測限為 0.11 μmol·L-1，熒光量子產(chǎn)率增加了62%。此外，細胞成像研究表明，Cou-HC可以有效地進行活細胞中的內(nèi)源和外源ClO-的低毒性成像。因此，Cou-HC在活細胞中ClO-的檢測具有潛在的應用前景。

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