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    中國(guó)荷斯坦牛HSPB8 基因與熱應(yīng)激反應(yīng)性狀相關(guān)性研究

    2021-06-19 02:34:08胡麗蓉劉嘉莉羅漢鵬楊明路黃錫霞王雅春
    中國(guó)畜牧雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:荷斯坦多態(tài)直腸

    張 帆,胡麗蓉,劉嘉莉,康 玲,羅漢鵬,楊明路,徐 青*,郭 剛,初 芹,黃錫霞,王雅春*

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100193;3.北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院,北京 100044;4.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司,北京 100029;5.北京市農(nóng)林科學(xué)院,北京 100089)

    熱應(yīng)激每年給奶牛業(yè)帶來(lái)巨大損失,已成為困擾全世界奶牛產(chǎn)業(yè)的難題之一。熱應(yīng)激環(huán)境下,多數(shù)動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生熱休克反應(yīng),機(jī)體表達(dá)大量的熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)。熱休克蛋白種類繁多,按分子量分為小分子熱休克蛋白(sHSP)、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 及泛素 7 個(gè)家族。在sHSP 家族中,HSPB8 蛋白亦稱為HSP22、H11 激酶,在氧化應(yīng)激[1-2]、線粒體自噬[3-5]、細(xì)胞凋亡[5-6]、炎癥反應(yīng)[7-9]中均有重要的功能。HSPB8 作為一種分子伴侶,能夠與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)結(jié)合,激活PI3K/Akt 通路,抑制細(xì)胞凋亡[10-11];與BAG3(Bcl-2-associated Anti-Apoptotic Gene 3)、HSP70、SYNPO2(Synaptopodin 2)結(jié)合,加快變性或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)修復(fù)和降解[12-15];與微管相關(guān)蛋白-2(Microtubule Associated Protein 2,MAP2)結(jié)合以維持細(xì)胞骨架完整[16-18],保護(hù)熱應(yīng)激下的細(xì)胞。此外,熱應(yīng)激時(shí)機(jī)體為減少產(chǎn)熱會(huì)增加糖代謝,減少脂代謝,細(xì)胞的能量需求量也會(huì)增加。而HSPB8 蛋白通過(guò)阻止二硫蘇糖醇誘導(dǎo)的胰島素聚集和熱誘導(dǎo)的檸檬酸合酶聚集,使三羧酸循環(huán)正常進(jìn)行,保證細(xì)胞的能量平衡[19-20]。因此,HSPB8 蛋白在細(xì)胞抗熱應(yīng)激中發(fā)揮重要作用,在熱應(yīng)激條件下過(guò)表達(dá)HSPB8 蛋白可以在一定程度上增加細(xì)胞的耐熱性[21-22]。

    在果蠅和水牛的研究中都發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以引起HSPB8基因表達(dá)顯著上調(diào)[19,23-24];2018 年,Sengar 等[25]研究發(fā)現(xiàn)牛熱應(yīng)激后表達(dá)顯著上調(diào)的1 個(gè)miRNA(btamiR-2898),在HSPB8基 因3'UTR 區(qū)域有2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)一步在外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)中證實(shí)了熱應(yīng)激引起btamiR-2898 的過(guò)表達(dá)能夠調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。Verma等[26]在沙希華牛群中發(fā)現(xiàn)HSPB8基因第一外顯子區(qū)g.507 G>A 突變不同基因型個(gè)體間的耐熱性存在顯著差異,并認(rèn)為該位點(diǎn)的AG 基因型可作為沙希華牛耐熱性選擇的遺傳標(biāo)記。

    本文從細(xì)胞水平研究了HSPB8基因的表達(dá)及其與中國(guó)荷斯坦牛熱應(yīng)激反應(yīng)性狀之間的相關(guān)性,為研究熱應(yīng)激反應(yīng)與奶牛重要候選基因遺傳多樣性的關(guān)系、篩選奶牛耐熱性相關(guān)遺傳標(biāo)記、培育耐熱品種提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 熱應(yīng)激條件下HSPB8基因的表達(dá)變化

    1.1.1 細(xì)胞熱應(yīng)激處理 奶牛外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)和牛腎細(xì)胞(Madin-Darbv Bovine Kidney,MDBK)為課題組保存的細(xì)胞模型[27]。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)[27]24 h 后,實(shí)驗(yàn)組42℃水浴處理1 h,對(duì)照組37℃處理1 h,每組12 個(gè)重復(fù)。

    1.1.2HSPB8基因mRNA 表達(dá)分析 利用NCBI 網(wǎng)站檢索目標(biāo)基因HSPB8和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA 序列,設(shè)計(jì)引物:HSPB8-F:TAAAATGTTGGGGGTCGGGG;HSPB8-R:TGCAATGGAGCATGACCTGT;GAPDH-F:GGCGCCAAGAGGGTCAT;GAPDH-R:AGGCATTG CTGACAATCTTGAG,進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量PCR 檢測(cè)。

    1.2HSPB8基因多態(tài)篩查

    1.2.1 DNA 池的構(gòu)建 選取70 頭無(wú)親緣關(guān)系的中國(guó)荷斯坦牛公牛,凍精樣品由北京奶牛中心提供。采用高鹽法[28]提取基因組DNA,NanoDrop 2000 檢測(cè)濃度后調(diào)整為100 ng/μL。隨機(jī)將樣品分成3 組(20、20、30 頭),根據(jù)DNA 濃度等量混合構(gòu)建3 個(gè)DNA 池,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 基因多態(tài)篩查 參考已知序列(NC_037344.1)共設(shè)計(jì)3 對(duì)引物(表1),涵蓋HSPB8基因全部編碼區(qū)、部分內(nèi)含子區(qū)及上下游調(diào)控區(qū)各500 bp。

    表1 HSPB8 基因多態(tài)篩查用引物信息

    PCR 反應(yīng)體系25 μL:DNA 池(100 ng/μL)0.5 μL,2×Taq Master Mix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL,ddH2O 10 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,根據(jù)測(cè)序峰圖與參考序列比對(duì)來(lái)判定多態(tài)性。

    1.3HSPB8多態(tài)性與熱應(yīng)激反應(yīng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

    1.3.1 熱應(yīng)激反應(yīng)性狀表型及估計(jì)育種值(EBVs)估計(jì) 熱應(yīng)激對(duì)奶牛造成的影響與體溫升高的幅度有關(guān)[29-30],耐熱性較好的個(gè)體體溫調(diào)節(jié)能力強(qiáng),熱應(yīng)激時(shí)體溫變化幅度小,應(yīng)激反應(yīng)小。奶牛有多種度量體溫的方法,其中直腸溫度具有穩(wěn)定性高且易檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),往往被作為體溫指標(biāo)的重要首選。此外,當(dāng)奶牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)時(shí),會(huì)表現(xiàn)出呼吸頻率加快、心率加快,同時(shí)出現(xiàn)張嘴呼吸伴隨流涎。因此,除直腸溫度外,呼吸評(píng)分和流涎指數(shù)也往往被作為衡量熱應(yīng)激反應(yīng)的生理指標(biāo)[31]。

    2013—2017 年夏季(THI>72),共測(cè)定北京地區(qū)12 541 頭中國(guó)荷斯坦母牛的直腸溫度、評(píng)分及流涎指數(shù)3項(xiàng)生理指標(biāo),方法參考文獻(xiàn)[31]。課題組共整理70 819 條數(shù)據(jù)(含系譜),其中1 665 頭實(shí)驗(yàn)牛(基因分型)每頭含有6 條表型數(shù)據(jù),直接使用表型值與SNP 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并不嚴(yán)謹(jǐn)。EBVs 在計(jì)算過(guò)程中去除了系統(tǒng)環(huán)境效應(yīng)和永久環(huán)境效應(yīng)對(duì)表型值的影響,使用熱應(yīng)激性狀的EBVs 與基因多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)性分析相對(duì)表型值來(lái)說(shuō),結(jié)果更準(zhǔn)確、更靈敏[32]。

    采用多性狀動(dòng)物模型借助DMU 軟件DMUAI 模塊[33-34]估計(jì)EBVs。系譜來(lái)自北京奶牛中心,包括1990—2017年共450 975 頭牛。模型為:

    其中,Yilkpmn為直腸溫度、呼吸評(píng)分或流涎指數(shù)表型;FYMi為固定效應(yīng),在直腸溫度評(píng)估中為場(chǎng)年組合效應(yīng),在呼吸評(píng)分和流涎指數(shù)評(píng)估中為場(chǎng)年評(píng)分人的組合效應(yīng);Ml為擠奶時(shí)間(前/后)效應(yīng);Timek為測(cè)定時(shí)間(上午/下午)效應(yīng);PARITYp為胎次(1、2、3、4、5、≥6)效應(yīng);DIM為泌乳天數(shù)效應(yīng);DIM2為泌乳天數(shù)二次項(xiàng);TEM為環(huán)境溫度;Am為加性遺傳效應(yīng);PEm為永久環(huán)境效應(yīng)。

    1.3.2 母牛DNA 的提取及基因分型 從上述有表型數(shù)據(jù)的母牛中隨機(jī)選取1 665 頭,來(lái)自北京地區(qū)9 個(gè)牧場(chǎng)。頸靜脈采血,肝素鈉抗凝,使用DNA 試劑盒(天根,DP318)提取基因組DNA,濃度檢測(cè)后調(diào)整至50 ng/μL備用。對(duì)篩選到的HSPB8基因的2 個(gè)SNPs,重新設(shè)計(jì)引物(表2),采用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specif ic PCR,KASP)分型[35],由中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司完成。

    表2 SNP 位點(diǎn)KASP 分型用引物信息

    1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用Haploview(version 4.2)軟件分別對(duì)HSPB8基因的SNPs 進(jìn)行連鎖不平衡分析,采用SAS 9.2 軟件對(duì)直腸溫度、呼吸評(píng)分和流涎指數(shù)的EBVs 與SNP 進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)和單倍型組合關(guān)聯(lián)分析,線性模型為Y=μ+G+e,其中Y表示各性狀EBVs,μ是總體均值,G為基因型效應(yīng),e為隨機(jī)殘差效。采用Bonferroni 法進(jìn)行同一SNP 不同基因型的多重比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熱應(yīng)激對(duì)HSPB8基因mRNA 表達(dá)量的影響 如圖1 所示,在PBMC 細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組HSPB8基因的表達(dá)量上調(diào)了2.17 倍(P<0.01);而在MDBK 細(xì)胞中,HSPB8基因的表達(dá)量上調(diào)更加明顯,與對(duì)照組相比差異達(dá)到了6 倍(P<0.01)。

    圖1 熱應(yīng)激對(duì)HSPB8 基因表達(dá)的影響

    2.2 中國(guó)荷斯坦牛HSPB8基因多態(tài)性分析 采用DNA池測(cè)序法對(duì)HSPB8基因進(jìn)行多態(tài)性篩選,共檢測(cè)到2個(gè)SNPs(表3),一個(gè)位于內(nèi)含子2 區(qū)域,另一個(gè)位于3'UTR 區(qū)(圖2)。

    表3 中國(guó)荷斯坦牛HSPB8 基因多態(tài)位點(diǎn)

    圖2 HSPB8 基因多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序峰圖

    2.3HSPB8基因SNPs 與熱應(yīng)激反應(yīng)性狀的相關(guān)性 基因分型結(jié)果如表4 所示,卡方檢驗(yàn)表明,在中國(guó)荷斯坦牛群體 中g(shù).58406728G>A 和g.58406042A>G 這2 個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)(P>0.05)。二者均屬于中度多態(tài)標(biāo)記,多態(tài)信息含量(PIC)為0.37。對(duì)g.58406728G>A 位點(diǎn)而言,G 等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因,AG 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。而g.58406042A>G 位點(diǎn),A等位基因?qū)儆趦?yōu)勢(shì)等位基因,AG 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。

    表4 基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg 平衡的卡方檢驗(yàn)

    分別用這2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)與3 個(gè)熱應(yīng)激反應(yīng)性狀直腸溫度、呼吸評(píng)分和流涎指數(shù)的EBVs 進(jìn)行單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果如表5 所示。可以看出,g.58406728G>A位點(diǎn)與流涎指數(shù)EBVs 性狀顯著相關(guān),其中,GG 型個(gè)體的EBVs 顯著高于AA 型和AG 型個(gè)體,分別高0.097和0.083;AA 型個(gè)體的EBVs 數(shù)值最低,但與AG 型差異不顯著。

    表5 HSPB8 基因多態(tài)與直腸溫度EBVs、呼吸評(píng)分EBVs 和流涎指數(shù)EBVs 的關(guān)聯(lián)分析

    g.58406042A>G 位點(diǎn)分析結(jié)果顯示其與直腸溫度性狀呈顯著相關(guān)。AA 型個(gè)體的EBVs 極顯著低于GG 型;而雜合子AG 型EBVs 居中,與2 個(gè)純合子差異不顯著。

    2.4HSPB8基因SNPs 連鎖不平衡分析 單倍型分析結(jié)果顯示,2 個(gè)SNPs 具有較緊密的連鎖關(guān)系,D'=0.957,r2=0.912,二者均為標(biāo)簽SNP(圖3)。H1、H2 為優(yōu)勢(shì)單倍型,二者頻率之和為0.978(表6)。當(dāng)二者均為有利突變時(shí),其中單倍型組合為H3H3,但是H3H3的個(gè)體數(shù)量太少,僅有4 頭牛,不具有群體代表性,會(huì)導(dǎo)致所估計(jì)的總體均值具有較大誤差,因此未納入后續(xù)分析中。此外,為更準(zhǔn)確估計(jì)各單倍型組合的總體均值,本研究以個(gè)體百分比大于5%為標(biāo)準(zhǔn),篩選出了3 種優(yōu)勢(shì)單倍型組合(即H1H1、H1H2、H2H2)與表型性狀EBVs 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,分析結(jié)果如表7 所示。

    表6 單倍型頻率

    表7 單倍型組合相關(guān)性分析

    圖3 HSPB8 基因2 個(gè)SNPs 連鎖不平衡估計(jì)

    3 討 論

    3.1 熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSPB8基因的表達(dá) 本研究中,牛MDBK細(xì)胞和PBMC 細(xì)胞經(jīng)熱刺激處理后,HSPB8基因表達(dá)量都極顯著上調(diào)。Boardman[23]和Kirbach[36]分別對(duì)果蠅和大鼠的組織進(jìn)行熱處理,均發(fā)現(xiàn)HSPB8基因表達(dá)顯著上調(diào),這也與本研究結(jié)果一致。根據(jù)目前的研究顯示,HSPB8基因受熱應(yīng)激誘導(dǎo)顯著上調(diào)可能與熱休克因子1(Heat Shock Factor 1,HSF1)過(guò)磷酸化激活有關(guān)。Vydra 等[37]使用雌激素磷酸化HSF1 發(fā)現(xiàn),HSF1與HSPB8基因啟動(dòng)子區(qū)域的熱休克原件(Heat Shock Elements,HSEs)結(jié)合能力增加,并導(dǎo)致HSPB8基因過(guò)表達(dá)。Anckar 等[38]也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSF 過(guò)度磷酸化,增強(qiáng)與HSPB8基因啟動(dòng)子區(qū)域HSEs 的結(jié)合。但HSF1 的激活過(guò)程十分復(fù)雜,有人認(rèn)為熱休克蛋白水平和細(xì)胞蛋白損傷程度的平衡可以作為應(yīng)激的敏感因子激活HSF1[39]。2006 年,Shamovsky 等[40]研究發(fā)現(xiàn)HSF1 可以由一種核糖核蛋白復(fù)合物激活,這種復(fù)合物中包含一類RNA 分子,這類RNA 在細(xì)胞中可能作為溫度感受器發(fā)揮作用,當(dāng)溫度變化時(shí),其構(gòu)像發(fā)生變化,并最終導(dǎo)致HSF1 的激活[41]。

    3.2 中國(guó)荷斯坦牛HSPB8基因多態(tài)與熱應(yīng)激反應(yīng) 本研究在中國(guó)荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)HSPB8基因的2 個(gè)SNPs,一個(gè)位于內(nèi)含子2,一個(gè)位于3'UTR 區(qū)。Nishant 等[26]在沙希瓦華牛群體中發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNPs,分別是g.507G>A和g.881T>C,與本研究檢測(cè)到的突變位點(diǎn)沒有重疊,這可能與品種的特異性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HSPB8基因的多態(tài)位點(diǎn)與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)性狀間存在顯著的相關(guān)性。其中,位于內(nèi)含子2 上的位點(diǎn)g.58406728G>A 與流涎指數(shù)EBVs 顯著相關(guān)。本研究對(duì)流涎指數(shù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括流涎與否和口鼻干濕情況,理論上流涎指數(shù)越低代表牛越耐熱,AA 型和AG 型的EBVs 顯著低于GG 型,意味著AA 型和AG 型個(gè)體的耐熱性可能高于GG 型個(gè)體,這也意味著A 等位基因有作為耐熱育種標(biāo)簽的潛力。

    此外,位于3'UTR 區(qū)的位點(diǎn)g.58406042A>G 則與直腸溫度EBVs 顯著相關(guān),AA 型EBVs 值極顯著低于GG 型。直腸溫度是個(gè)體對(duì)于環(huán)境溫度變化生理調(diào)節(jié)反應(yīng)的直接表現(xiàn),熱應(yīng)激耐受型奶牛的直腸溫度顯著低于敏感個(gè)體[9],因此判斷AA 型個(gè)體較GG 型個(gè)體更耐熱,在育種中可以作為熱應(yīng)激耐受型個(gè)體的重要參考遺傳標(biāo)記。目前有研究表明位于3'UTR 上的SNP 可以通過(guò)改變miRNA 與其結(jié)合能力來(lái)影響基因的表達(dá)[42]。Sengar等[25]也發(fā)現(xiàn)奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)的miRNA(bta-miR-2898)能夠靶向結(jié)合HSPB8基因3'UTR 區(qū)進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。

    本研究中檢測(cè)的2 個(gè)SNPs 位點(diǎn)分別與奶牛流涎指數(shù)EBVs、直腸溫度EBVs 顯著相關(guān),這可能與直腸溫度和流涎的發(fā)生和發(fā)展具有異相性有關(guān)。當(dāng)熱應(yīng)激不嚴(yán)重時(shí),奶牛主要通過(guò)皮膚出汗進(jìn)行散熱,此時(shí)牛群的流涎指數(shù)可能會(huì)趨向同質(zhì),即很少出現(xiàn)流涎的現(xiàn)象。而當(dāng)奶牛處于嚴(yán)重的熱應(yīng)激時(shí),皮膚出汗已無(wú)法滿足散熱需求,這時(shí)機(jī)體會(huì)采用加快呼吸頻率的方式散熱,但當(dāng)呼吸頻率升高到一定程度時(shí),會(huì)轉(zhuǎn)為喘息,且出現(xiàn)流涎的現(xiàn)象。因此,直腸溫度和流涎指數(shù)是從不同角度去評(píng)估熱應(yīng)激,具有不同的生物學(xué)意義。本研究中,2 個(gè)位點(diǎn)與不同的生理指標(biāo)具有相關(guān)性,說(shuō)明二者參與不同的調(diào)控過(guò)程,在奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中均具有非常重要的意義。此外,這2 個(gè)位點(diǎn)與呼吸評(píng)分EBVs 均未有顯著的相關(guān)關(guān)系,可能與奶牛在熱應(yīng)激反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)第二項(xiàng)呼吸有關(guān)。穆玉云等[43]也認(rèn)為當(dāng)牛體溫上升到一定程度會(huì)出現(xiàn)第二項(xiàng)呼吸,使呼吸頻率下降,而耐熱的牛呼吸頻率仍可保持著較高水平,其認(rèn)為呼吸頻率作為牛的耐熱指標(biāo)不完全準(zhǔn)確。在單倍型關(guān)聯(lián)分析中,3 種單倍型組合與直腸溫度EBVs、呼吸評(píng)分EBVs、流涎指數(shù)EBVs均無(wú)顯著相關(guān)性。優(yōu)勢(shì)單倍型均不為最優(yōu)等位基因組合,而是GA 或者AG,這可能是導(dǎo)致單倍型與表型性狀EBVs 關(guān)聯(lián)不顯著的原因。

    4 結(jié) 論

    本研究從細(xì)胞水平和分子水平表明奶牛HSPB8基因是與荷斯坦牛熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要候選基因。奶牛MDBK 和PBMC 細(xì)胞經(jīng)熱處理后,HSPB8基因表達(dá)量均極顯著上調(diào),證明HSPB8是奶牛體內(nèi)受熱應(yīng)激誘導(dǎo)的重要基因。進(jìn)一步,在中國(guó)荷斯坦牛群中檢測(cè)到HSPB8基因的2 個(gè)SNPs,與奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)直腸溫度、呼吸評(píng)分、流涎指數(shù)估計(jì)育種值(EBVs)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,位于3'UTR 區(qū)的g.58406042A>G 位點(diǎn)和位于內(nèi)含子2 上的g.58406728G>A 位點(diǎn)分別與直腸溫度和流涎指數(shù)EBVs 顯著相關(guān),2 個(gè)位點(diǎn)具有A 等位基因的個(gè)體比具有G 等位基因的個(gè)體更耐熱,可用于分子標(biāo)記輔助育種培育耐熱中國(guó)荷斯坦牛群體。

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