miR-338-3p通過(guò)靶向RUNX2負(fù)調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化且促進(jìn)骨質(zhì)疏松

劉國(guó)樑，秦明照

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院干部醫(yī)療/老年醫(yī)學(xué)科，北京 100730)

骨質(zhì)疏松癥是一種內(nèi)分泌和代謝性疾病，常伴隨并發(fā)骨礦物質(zhì)密度和骨質(zhì)量的降低[1-2]。導(dǎo)致患者易發(fā)生脆性骨折[3]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow stromal cells，hBMSCs)的分化調(diào)控參與多種分子途徑調(diào)控，在成骨性疾病的干細(xì)胞治療中顯示出較良好的潛力[4]。微核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)參與生物學(xué)過(guò)程，在骨骼發(fā)育、骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，可作為治療骨類(lèi)疾病的新的潛在靶點(diǎn)[5-6]。miRNA-153通過(guò)靶向II型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體抑制人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[7]。在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA-214的上調(diào)增加了骨質(zhì)疏松小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量[8]。RUNX2作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)正常骨骼發(fā)育和分化至關(guān)重要[9-10]。本研究通過(guò)探討miRNA-338-3p在hBMSCs成骨分化中的作用及其與RUNX2的相互關(guān)系，旨在為骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院收治的60例骨質(zhì)疏松癥患者為研究對(duì)象。其中，男性36例，女性24例；平均年齡(73.12±8.27)歲；所有患者均符合骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)惡性腫瘤患者；(2)合并腦出血或顱內(nèi)出血史；(3)合并嚴(yán)重心、肝等系統(tǒng)性疾病者；(4)合并感染、自身免疫類(lèi)疾病者。另選60名同期非骨質(zhì)疏松者作為對(duì)照組。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

兩組入院時(shí)，收集其病歷資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙飲酒情況及合并基礎(chǔ)病等。入院后清晨，采集兩組靜脈血8 mL，靜置30 min后，4 ℃，3 000 g/min離心10 min。取上清(非溶血狀態(tài))在4 ℃再次離心，135 000 g/min，持續(xù)15 min。隨后，將血清標(biāo)本分裝，每管200 μL，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 hBMSCs的分離和培養(yǎng)

首先，采用骨髓粘連法從骨質(zhì)疏松癥患者和對(duì)照組中提取10 mL新鮮骨髓置于無(wú)菌離心管中，采用密度梯度離心法分離hBMSCs細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察hBMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)，選用第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究[12]。分離的hBMSCs培養(yǎng)在phenol red-free α-minimum Eagle’s培養(yǎng)基中 (α-MEM；HyClone，Logan，UT，USA)，含10%胎牛血清 (FBS-HI)(Gibco，Grand Island，NY，USA)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Gibco，Grand Island，NY，USA)。培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q1次，細(xì)胞傳代至90%融合度。然后，將hBMSCs在phenol red-free α-minimum Eagle’s培養(yǎng)基中培養(yǎng) (α-MEM；HyClone，Logan，UT，USA)，含1%胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS-HI)( Gibco，Grand Island，NY，USA)，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Gibco，Grand Island，NY，USA)，抗壞血酸50 μg/mL(Gibco，Grand Island，NY，USA)，10 mM甘油磷酸酯和0.1 μg /mL地塞米松(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miRNA-338-3p模擬物(miRNA-338-3p mimics，5’-GGGTCCAGCATCAGTGATT-3’)、miRNA-338-3p抑制劑(miRNA-338-3p inhibitor，5’-CCCAGGTCGTAGTCACTAA-3’)、RUNX2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(RUNX2)或陰性對(duì)照(miR-NC)均購(gòu)自上?；蛑扑幱邢薰?中國(guó)上海)。按照Lipofectamine RNAIMAX轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))的說(shuō)明書(shū)，將miRNA-338-3p模擬物、miRNA-338-3p抑制劑、RUNX2過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照轉(zhuǎn)染到hBMSCs細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染前24 h，將融合度為75%的細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染當(dāng)天將Lipofectamine RNAIMAX轉(zhuǎn)染試劑與opti-MEM培養(yǎng)液及合成的miRNA-338-3p模擬物、miRNA-338-3p抑制劑、RUNX2或陰性對(duì)照均勻混合，室溫孵育5～10 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗1次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

嚴(yán)格按照TRIzol試劑操作說(shuō)明(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取骨質(zhì)疏松患者、對(duì)照組血清和hBMSCs中的總RNA。采用Nanodrop光譜儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測(cè)RNA純度和濃度。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA (Thermo Scientific，CA，USA)。采用ABI PRISM 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 2 x SYBR qPCR Mix(北京中曼生物技術(shù)有限公司，中國(guó))檢測(cè)miR-338-3p的水平。擴(kuò)增體系如下：PCR反應(yīng)包含2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL H2O2和10 μL SYBR；擴(kuò)增條件為25 ℃，10 min，48 ℃，30 min，95 ℃，5 min，U6作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。SYBR Green檢測(cè)RUNX2蛋白、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、I型膠原蛋白(collagen I)mRNA表達(dá)水平，GAPDH作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平。所用引物如表2。

表2 RT-qPCR引物序列

1.5 Western blot

為探討miR-338-3p對(duì)RUNX2蛋白表達(dá)的影響，采用冷的PBS洗滌hBMSCs兩次，然后用RIPA裂解緩沖液裂解(江蘇Beyotime生物技術(shù)研究所)和蛋白酶抑制劑(Roche，中國(guó))提取所用總蛋白。使用BCA蛋白分析試劑盒(江蘇Beyotime生物技術(shù)研究所)對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。取50 μg總蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%脫脂乳封閉1 h，加入一抗(RUNX2 (1∶1 000；Abcam，USA))，GAPDH濃度1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜，隨后，將聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜用三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline，TBS)洗滌3次，每次10 min。加入羊抗兔二抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology Inc.，MA，USA)室溫孵育2 h，TBS洗滌3次，每次10 min。采用Fusion FX5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測(cè)

用磷酸鹽緩沖溶液洗滌hBMSCs (PBS；Gibco，Grand Island，NY，USA)，用1% Triton X-100裂解15 min，10 000 g離心5 min。收集上清液，根據(jù)堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定堿性磷酸酶活性(DALP-250，Abcam，Cambridge，MA，USA)，采用酶標(biāo)儀(Promega，Madison，WI，USA)在波長(zhǎng)為450 nm下檢測(cè)光密度(optical density，OD)。

1.7 茜素紅染色

采用冷的PBS洗滌hBMSCs兩次，用70%乙醇預(yù)冷固定，吸去固定液，采用ddH2O洗滌hBMSCs 5次。隨后用40 mm茜素紅染色10～15 min，用ddH2O清洗5次。最后用倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)觀察并捕獲鈣化結(jié)節(jié)(橙色)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將hBMSCs細(xì)胞接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染前孵育24 h，待細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，將miR-338-3p模擬物和miR-NC分別于RUNX2 3’-UTR野生型或突變型重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Renilla luciferase報(bào)告基因(pRL-CMV；Promega，USA)檢測(cè)熒光素酶活性。報(bào)告基因活性采用熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega，USA)根據(jù)生產(chǎn)廠家的方案進(jìn)行測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miRNA-338-3p在骨質(zhì)疏松患者血清中的表達(dá)情況

RT-qPCR分析顯示，骨質(zhì)疏松患者血清中miRNA-338-3p水平相比健康對(duì)照組表達(dá)量上升(P<0.05)(圖1A)；此外，分別在0、7、14和21 d測(cè)定hBMSCs成骨分化中miRNA-338-3p的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示，miRNA-338-3p的表達(dá)隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(P<0.05)(圖1B)。

2.2 miR-338-3p過(guò)表達(dá)對(duì)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

為了闡明miR-338-3p在成骨分化中的潛在功能，構(gòu)建miR-338-3p模擬物和抑制劑，RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染hBMSCs后的效果發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。miR-338-3p過(guò)表達(dá)下調(diào)了OCN、OPN和Collagen I mRNA的表達(dá)，相反，miR-338-3p敲低上調(diào)了OCN、OPN和Collagen I mRNA表達(dá)水平(圖2B-D)。與對(duì)照組相比，miR-338-3p過(guò)表達(dá)削弱了其礦化能力(P<0.05)(圖2E)。過(guò)表達(dá)miR-338-3p的hBMSCs細(xì)胞系中ALP活性下降(P<0.05)(圖2F)。

2.3 RUNX2是miR-338-3p的直接作用靶基因

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，RUNX2基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)包含了一個(gè)miR-338-3p的靶序列(圖3A)。在hBMSCs細(xì)胞系中，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了RUNX2是miR-338-3p的直接靶點(diǎn)(WT：miR-NC(1.10±0.22)，miR-338-5p-mimic(0.45±0.05)；MT：miR-NC(0.98±0.16)，miR-338-5p-mimic(1.01±0.18)(圖3B)。此外，western blot和RT-qPCR分析表明，與對(duì)照組相比，miR-338-3p過(guò)表達(dá)降低了RUNX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖3C-D)；相反，miR-338-3p敲低上調(diào)了RUNX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖3C-D)。

2.4 miR-338-3p通過(guò)抑制RUNX2的表達(dá)抑制成骨分化

為進(jìn)一步探討miR-338-3p在成骨分化中的作用機(jī)制，在hBMSCs細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-338-3p模擬物和miR-338-3p模擬物+RUNX2。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-338-3p可顯著降低ALP活性，而RUNX2過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖4A)。同樣，茜素紅染色顯示，過(guò)表達(dá)miR-338-3p的hBMSCs細(xì)胞系礦化能力明顯受到抑制，而通過(guò)共轉(zhuǎn)染miR-338-3pp模擬物和RUNX2，礦化程度進(jìn)一步升高(圖4B)。過(guò)表達(dá)miR-338-3p，OCN、OPN和collagen I mRNA的相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)。而在RUNX2過(guò)表達(dá)后，OCN、OPN和collagen I mRNA水平升高(圖4C-E)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的復(fù)雜疾病，其主要表現(xiàn)為骨骼微結(jié)構(gòu)惡化，強(qiáng)度受損，使之更易發(fā)生骨脆性骨折[13]。據(jù)估計(jì)，全球骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)超過(guò)7 500萬(wàn)人，每年與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的骨折超過(guò)150萬(wàn)人，到2050年髖部骨折預(yù)計(jì)將達(dá)到630萬(wàn)人[14-15]。骨骼的微觀結(jié)構(gòu)由礦化的細(xì)胞外基質(zhì)和骨重塑單元組成，包括骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞等[16]。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞對(duì)于骨骼的維持和重塑至關(guān)重要。骨形成和骨吸收之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致代謝性骨疾病，如骨吸收的過(guò)程快于新骨的形成，骨質(zhì)疏松癥將會(huì)發(fā)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者血清miR-338-3p水平相比對(duì)照組表達(dá)量明顯上升，miR-338-3p過(guò)表達(dá)影響OCN、OPN和Collagen I mRNA的水平,且明顯削弱了hBMSCs礦化能力和ALP活性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)，RUNX2是miR-338-3p的直接靶點(diǎn)。RUNX2過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-338-3p 對(duì)hBMSCs成骨分化的抑制作用。可見(jiàn)，miR-338-3p通過(guò)靶向RUNX2負(fù)調(diào)控hBMSCs的成骨分化，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。

miRNA是長(zhǎng)度為20～22個(gè)堿基的小型非編碼RNA，被認(rèn)為是一種重要的表觀遺傳修飾分子，可通過(guò)影響細(xì)胞分化和凋亡來(lái)介導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[18]。miRNA在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中的作用已得到廣泛的研究[19]。其中成骨細(xì)胞的分化是骨穩(wěn)態(tài)的重要過(guò)程， miRNA可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的生物學(xué)過(guò)程[20]。有研究[21]表明，miR-375通過(guò)靶向RUNX2抑制成骨細(xì)胞分化，同時(shí)降低了一些關(guān)鍵的成骨細(xì)胞標(biāo)志物的活性。miR-96通過(guò)抑制成骨細(xì)胞中HB-EGF/EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者血清中miRNA-338-3p水平相比健康對(duì)照組表達(dá)量明顯上升，此外，分別在0、7、14和21 d測(cè)定hBMSCs成骨分化中miR-338-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)顯示，miR-338-3p的表達(dá)隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低?？梢?jiàn)，miR-338-3p可能通過(guò)抑制成骨分化，進(jìn)而影響骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。

miR-338-3p通過(guò)下調(diào)WNT2B蛋白增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[23]，通過(guò)抑制MACC1基因阻礙結(jié)直腸癌的進(jìn)展[24]，通過(guò)靶向蛋白磷酸酶4調(diào)節(jié)亞單位1(protein phosphatase 4 regulator subunit 1，PP4R1)調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶4 (protein phosphatase 4，PP4)表達(dá)來(lái)介導(dǎo)肝細(xì)胞核因子4α(hepatic nuclear factor 4α，HNF-4α)[25]。miR-338-3p的過(guò)表達(dá)還可抑制成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物的表達(dá)，從而減少成骨細(xì)胞分化[26]?？梢?jiàn)，miR-338-3p有可能成為治療多種疾病的潛在靶點(diǎn)，且與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。ALP、Collagen I是早期成骨分化的標(biāo)志物，而OCN和OPN是其晚期分化的標(biāo)志物[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)了OCN、OPN和Collagen I mRNA的表達(dá)，相反，miR-338-3p敲低上調(diào)了OCN、OPN和Collagen I mRNA表達(dá)水平。此外，miR-338-3p過(guò)表達(dá)削弱了hBMSCs礦化能力和ALP活性，表明miR-338-3p對(duì)成骨分化具有較明顯的抑制作用。

hBMSCs在成骨分化的過(guò)程中有多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)，如RUNX2/Cbfa1、Osx等[28]。其中RUNX2對(duì)于成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要。RUNX2在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，在敲除RUNX2的小鼠中，成骨細(xì)胞和骨形成，軟骨細(xì)胞成熟均明顯受到抑制[29]。近年來(lái)，有研究[30]發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)調(diào)控RUNX2的表達(dá)來(lái)影響成骨分化。如，miR-133通過(guò)靶向RUNX2抑制小鼠C2C12細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。Kim等[31]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)小鼠C3H10T1/2細(xì)胞中的miR-433，可直接抑制RUNX2和BMP-2的轉(zhuǎn)錄后水平。Vimalraj等[32]證明了Smurf1通過(guò)蛋白酶體途徑降解RUNX2。而在BMSCs中，miR-15b通過(guò)下調(diào)Smurf1可上調(diào)RUNX2水平?？梢?jiàn)，RUNX2與上下游分子相互作用，進(jìn)一步影響骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，在骨質(zhì)疏松癥中起重要作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，RUNX2基因的3’UTR包含了一個(gè)miR-338-3p的靶序列，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了RUNX2是miR-338-3p的直接靶點(diǎn)。miR-338-3p過(guò)表達(dá)降低了RUNX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。而RUNX2過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-338-3p對(duì)成骨分化的抑制作用?？梢?jiàn)，RUNX2在骨質(zhì)疏松癥中至關(guān)重要。

綜上所述，miR-338-3p在骨質(zhì)疏松中高表達(dá)，隨著成骨分化時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸減少。此外，miR-338-3p通過(guò)靶向RUNX2負(fù)調(diào)控hBMSCs的成骨分化，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松的進(jìn)展。