響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏多糖超聲輔助提取工藝及其結(jié)構(gòu)表征

朱和權(quán)，馮 進(jìn)，李春陽, ，吳承東，張 明，Chuon Mony Roth

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 江蘇南京 210014；3.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站, 江蘇鹽城 224005；4.柬埔寨農(nóng)業(yè)漁業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品和食品實(shí)驗(yàn)室, 金邊 10103）

植物多糖具有抗氧化[8]、調(diào)節(jié)免疫[9]、降血糖[10]、抗腫瘤[11]、調(diào)節(jié)腸道菌群[12]等多種藥理作用。植物多糖的提取技術(shù)有很多，除了傳統(tǒng)的水提醇沉法，還有酶法[13]、超聲波提取法[14]、酸提法[15]、堿提法[16]及新興的微波輔助提取法[17]和亞臨界水萃取法[18]等。超聲波法提取多糖具有效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，Gu等[19]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波提取慈姑多糖的工藝，并發(fā)現(xiàn)超聲波法提取到的慈姑多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。由于白首烏中淀粉含量較高，采用傳統(tǒng)水提醇沉法提取時(shí)需要加入α-淀粉酶及糖化酶處理，導(dǎo)致白首烏多糖得率偏低[20]。為了提高白首烏中非淀粉多糖的得率，本文根據(jù)白首烏中淀粉在較低溫度下不溶水的特性，選擇超聲波法在較低溫度下提取白首烏中非淀粉多糖，從而避免了通過α-淀粉酶-糖化酶聯(lián)用法除淀粉導(dǎo)致的多糖的損失。采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)超聲波法提取的白首烏多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)表征，為日后對(duì)白首烏多糖結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白首烏粉末 鹽城果老首烏科技有限公司提供；無水乙醇，苯酚、濃硫酸、溴化鉀 為國(guó)產(chǎn)分析純；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）及葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司。

L3-5K臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；EU-2600R紫外可見分光光度計(jì) 上海昂拉儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52AA型真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白首烏多糖的提取 稱取100 g白首烏超微粉末于燒杯中以蒸餾水作為提取溶劑，按照一定液料比、超聲功率、超聲溫度及超聲時(shí)間進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，將提取液倒入離心杯中，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)入旋蒸瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/4體積，隨后采用Sevag法[21]除蛋白，加入4倍體積的無水乙醇置于4 ℃條件下過夜醇沉。將醇沉液于4000 r/min離心10 min，棄去上清液，將沉淀用80%的乙醇洗滌三次，最后用去離子水將沉淀復(fù)溶，透析48 h后凍干，得白首烏多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.1中的提取方法，實(shí)驗(yàn)基本條件定為：液料比20:1 mL/g，超聲時(shí)間40 min，超聲功率300 W和超聲溫度40 ℃。因素實(shí)驗(yàn)條件為液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、超聲功率（200、250、300、350、400 W）和超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃），分別考察液料比、超聲時(shí)間、超聲功率和超聲溫度對(duì)白首烏多糖得率得影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)對(duì)超聲輔助提取白首烏多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平表見表1。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并比較預(yù)測(cè)多糖得率與實(shí)際多糖得率。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平表設(shè)計(jì)Table 1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.2.4 白首烏多糖含量得測(cè)定 采用硫酸-苯酚法[22]檢測(cè)粗多糖中多糖含量，繪制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=15.65x-0.00742（其中Y為吸光度，A；x為葡萄糖濃度，mg/mL），R2=0.9998，按照公式（1）計(jì)算多糖得率：

劉訓(xùn)峰在講話中表示，與臨港的戰(zhàn)略合作是國(guó)資聯(lián)手開發(fā)桃浦智創(chuàng)城的新起點(diǎn)、新篇章，也是雙方開啟未來合作的新契機(jī)，未來將繼續(xù)加強(qiáng)良性互動(dòng)，實(shí)現(xiàn)共同發(fā)展。

式中，y：超聲波提取多糖得率，%；C：由標(biāo)曲計(jì)算所得多糖濃度，mg/mL；V：定容體積，mL；N：稀釋倍數(shù)；m：測(cè)定所用得粗多糖質(zhì)量，mg；M：粗多糖質(zhì)量，g；W：提取用白首烏粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 白首烏多糖的理化性質(zhì)研究

1.2.5.1 白首烏多糖的單糖組成測(cè)定 白首烏多糖的單糖組成的測(cè)定采用離子色譜法（IC）[23]。取干凈的色譜瓶，稱量多糖樣品5 mg，加入配制好的2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，121 ℃加熱2 h。通氮?dú)?，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重?fù)甲醇清洗2～3次。加入無菌水溶解，過0.22 μm微孔過濾膜后，供進(jìn)樣分析。

儀器配置及檢測(cè)條件：Thermo ICS5000+離子色譜系統(tǒng)，電化學(xué)檢測(cè)器，CarboPac PA20液相色譜柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaOH 淋洗液，0.5 mL/min流速。

1.2.5.2 白首烏多糖的分子量分布測(cè)定 白首烏多糖的分子量分布使用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測(cè)定[24]。將樣品充分溶解于流動(dòng)相中，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（Mw180、Mw2700、Mw9750、Mw36800、Mw135350）制作校正曲線。校正曲線為lgMw=-0.2679tR+10.8092 ，其中Mw為標(biāo)準(zhǔn)樣品的平均相對(duì)分子量，tR為保留時(shí)間（min），R2=0.9956。

儀器配置及檢測(cè)條件儀器：Waters1525 高效液相色譜儀（2414示差折光檢測(cè)器和Empower3工作站），Ultrahydrogel? Linear 300 mm×7.8 mm×2 μm色譜柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaNO3淋洗液，流速為0.9 mL/min。

1.2.5.3 白首烏多糖的紅外光譜測(cè)定 取2 mg干燥樣品與200 mg KBr混合并研細(xì)均勻，壓成薄片，傅里葉紅外光譜儀在4000～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.5.4 白首烏多糖溶解度測(cè)定 白首烏多糖的溶解度測(cè)定參考Huang等[25]的方法。稱取500 mg的白首烏多糖樣品，溶解于5 mL蒸餾水中并且在常溫下攪拌6 h，隨后在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，計(jì)算上清液體積，收集沉淀并烘至恒重，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。白首烏多糖的溶解度根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中，y：白首烏多糖的溶解度，mg/mL；M：多糖樣品質(zhì)量，mg；m：烘干后沉淀質(zhì)量，mg；V：上清液的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及顯著性檢驗(yàn)采用Origin9.6軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)及結(jié)果與方差分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖1可知，隨著液料比的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當(dāng)液料比為20:1 mL/g時(shí)，白首烏多糖得率最高，此時(shí)多糖得率為1.14%。這是因?yàn)?，?dāng)液料比較低時(shí)，溶劑與樣品接觸不充分從而導(dǎo)致提取不徹底。隨著液料比的繼續(xù)增加，多糖的得率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)殡S著液料比的增加使隨后的料液的分離濃縮操作難度增加，導(dǎo)致多糖的損失增加。因此選擇液料比20:1 mL/g。

圖1 液料比對(duì)白首烏多糖得率的影響Fig.1 Effect of solvent to material ratio on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，白首烏多糖得率最高，此時(shí)多糖得率為1.25%。這是因?yàn)椋S著時(shí)間的增加，多糖得率增加，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，多糖已經(jīng)基本溶出，此時(shí)多糖得率為1.25%。隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)增加，不會(huì)提高白首烏多糖的得率，反而使部分小分子多糖降解，導(dǎo)致得率下降[26]。因此選擇超聲時(shí)間40 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)白首烏多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.3 超聲功率對(duì)超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖3可知，隨著超聲功率的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當(dāng)超聲功率為350 W時(shí)，白首烏多糖得率最高，此時(shí)多糖得率為1.27%。這是因?yàn)殡S著超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)和震動(dòng)利于多糖的溶解。隨著超聲功率的繼續(xù)增加，多糖得率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)檫^高的超聲波功率會(huì)導(dǎo)致多糖的降解[27]，因此選擇超聲功率350 W。

圖3 超聲功率對(duì)白首烏多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.4 超聲溫度對(duì)超聲波輔助提取白首烏多糖得率的影響 由圖4可知，隨著超聲溫度的增加，白首烏多糖得率逐漸升高，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，多糖得率最高為1.29%，這是因?yàn)闇囟鹊纳呖梢蕴岣叨嗵堑娜芙舛取ｋS著超聲溫度的繼續(xù)升高，多糖得率開始下降，這是因?yàn)楫?dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，有部分水溶性淀粉隨多糖一起溶解，需要對(duì)提取液做去淀粉處理，在去淀粉的過程中導(dǎo)致白首烏多糖的損失。因此選擇超聲溫度50 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)白首烏多糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理設(shè)計(jì)了29組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行擬合分析。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 對(duì)白首烏多糖得率的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。對(duì)四個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合后得到回歸方程：Y=1.31+0.12A+0.23B-0.11C+0.055D+0.12AB+0.10AC+0.080AD+0.045BC+0.052BD+0.098CD-0.21A2-0.39B2-0.21C2-0.33D2。由方差分析可知，校正系數(shù)R2=0.9796,R2Adj=0.9592；模型的P值小于0.0001，為極顯著；失擬項(xiàng)P值大于0.05，不顯著。這說明模型擬合度較好，說明實(shí)驗(yàn)的二次模型擬合度較高，可正確反映個(gè)因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。由模型的方差分析可得出液料比與超聲溫度交互項(xiàng)（AD）對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（P＜0.05），而液料比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、超聲溫度（D）、液料比與超聲時(shí)間交互項(xiàng)（AB）、液料比與超聲功率交互項(xiàng)（AC）、超聲功率與超聲溫度交互項(xiàng)（CD）及各因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值具有極顯著影響（P＜0.01）。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性排序?yàn)锽＞A＞C＞D。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface method design and test results

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

兩因素之間交互作用的響應(yīng)面圖見圖5。兩個(gè)因素之間的交互作用可以通過響應(yīng)面表示出來，兩因素交互項(xiàng)的三維圖越陡峭，等高線呈橢圓則表明這兩個(gè)因素的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。圖中三維圖的陡峭順序?yàn)锳B＞AC＞CD＞AD＞BD＞BC，即液料比與超聲時(shí)間交互項(xiàng)、液料比與超聲功率交互項(xiàng)、超聲功率與超聲溫度交互項(xiàng)以及液料比與超聲溫度交互項(xiàng)三維圖最陡峭，表明超聲時(shí)間與液料比之間的交互作用、液料比與超聲功率之間的交互作用、超聲功率與超聲溫度之間的交互作用以及液料比與超聲溫度之間的交互作用對(duì)白首烏多糖得率的影響顯著；從等高線來，BC與BD的等高線接近圓形，表明超聲時(shí)間與超聲功率之間的交互作用及超聲時(shí)間與超聲溫度之間的交互作用對(duì)白首烏多糖得率的影響不顯著（P＞0.05），這與模型的方差分析相一致。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)Design-Expert8.0.6預(yù)測(cè)模型極值點(diǎn)，結(jié)果顯示最佳提取條件：液料比21.96:1 mL/g、超聲時(shí)間為43.63 min、超聲功率為345.53 W、超聲溫度為51.45 ℃。在此最佳提取條件下白首烏多糖得率為1.39%。根據(jù)實(shí)際操作設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其提取條件為：液料比為22:1 mL/g、超聲時(shí)間為44 min、超聲功率為350 W及超聲溫度為52 ℃，按此提取條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在此條件下的多糖得率為1.35%±0.02%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值的誤差為2.88%，誤差較小，表明該模型擬合度良好，對(duì)超聲波法提取白首烏多糖的工藝優(yōu)化合理、有效。

圖5 兩因素的交互作用對(duì)白首烏多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3 白首烏多糖表征

2.3.1 單糖組成結(jié)果分析 由圖6和圖7可知，白首烏多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，其含量分別為0.17%、1.66%、7.40%、10.51%、74.41%、0.79%、0.85%、0.36%、3.28%、0.57%。由白首烏多糖的單糖組成數(shù)據(jù)可以得出該多糖中葡萄糖含量最高，說明白首烏多糖的主要組成為葡聚糖，這對(duì)其結(jié)構(gòu)解析具有一定的參考價(jià)值。

圖6 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatography of complex standard monosaccharides and uronic acids

圖7 白首烏多糖的單糖分析離子色譜圖Fig.7 Ion chromatography of of monosaccharide in polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.2 分子量測(cè)定結(jié)果分析 由圖8和表4可知超聲波法提取的白首烏多糖分子量分布狀況，其重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，其多分散系數(shù)分別為1.40、1.55、1.65，峰面積比為14.28%、21.18%、64.54%。

2.3.3 白首烏多糖紅外光譜分析 如圖9所示，白首烏多糖在3297 cm-1左右處有一處較寬的吸收峰，該峰是由O-H伸縮振動(dòng)引起的，在2915 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是由C-H伸縮振動(dòng)引起的。這兩個(gè)峰為多糖的特征峰。在1645 cm-1處出現(xiàn)的峰則是由-COOH伸縮振動(dòng)引起的，說明白首烏多糖中存在-COOH，這一點(diǎn)與白首烏多糖的單糖組成測(cè)定結(jié)果一致[28]。此外在1200～950 cm-1處出現(xiàn)的一組較強(qiáng)的吸收峰是吡喃糖環(huán)上的醚鍵（C-O-C）的伸縮振動(dòng)及羥基O-H變角振動(dòng)引起的[29]。在850 cm-1處的吸收峰為β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰[30]。紅外光譜掃描結(jié)果顯示白首烏多糖中含有β構(gòu)型的吡喃糖，同時(shí)白首烏多糖中含有一定的糖醛酸，這與其單糖組成測(cè)定結(jié)果一致。

圖8 白首烏多糖相對(duì)分子量分布的高效液相色譜圖Fig.8 HPLC sepectrum of relative molecular weight of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

表4 白首烏多糖分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight polysaccharide

圖9 白首烏多糖的紅外吸收光譜圖Fig.9 FTIR spectra of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.4 白首烏多糖溶解度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白首烏多糖的溶解度為（25.89±0.36）mg/mL，具有較好的溶解度。這可能是因?yàn)榘资诪醵嗵侵械头肿恿拷M分比較多從而使其具有良好的溶解度[31]。多糖的溶解度在功能性食品加工中具有重要的意義?？梢钥紤]將其加入到飲料中，做成低端消費(fèi)品，也可以將其加入到高端的功能性食品，提高其附加值。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取白首烏多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上以響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明：模型擬合度較好，實(shí)驗(yàn)的二次模型擬合度較高，四個(gè)因素對(duì)多糖提取量影響順序?yàn)槌晻r(shí)間（B）＞液料比（A）＞超聲功率（C）＞超聲溫度（D），超聲輔助提取白首烏多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：液料比22:1 mL/g、超聲時(shí)間為44 min、超聲功率為350 W及超聲溫度為52 ℃，此時(shí)多糖得率為1.35%±0.02%。白首烏多糖結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明：白首烏多糖由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸組成，重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，具有一般多糖紅外光譜吸收峰以及良好的溶解性，為白首烏多糖結(jié)構(gòu)解析及工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。