超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定醬鹵肉制品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑

閔宇航，黃璐瑤，余曉琴，王 穎

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川成都 610097）

焦糖色是一種食品添加劑，不僅能起到增色增香的作用，還有助于提高食品品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于醬油、食醋、料酒、烘焙食品、糖果、飲料等多種食品的生產(chǎn)中。焦糖色按生產(chǎn)工藝可以分為四類：Ⅰ類為普通法焦糖色，Ⅱ類為苛性亞硫酸鹽法焦糖色，Ⅲ類為氨法焦糖色，Ⅳ類為亞硫酸銨法焦糖色。在焦糖色的生產(chǎn)過(guò)程中主要發(fā)生了美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)。普通的焦糖色主要發(fā)生焦糖化反應(yīng)，而加入了氨（銨）作為催化劑的Ⅲ、Ⅳ類焦糖色以美拉德反應(yīng)為主。與非氨（銨）法生產(chǎn)相比，氨（銨）法生產(chǎn)焦糖色具有反應(yīng)快、周期短、呈色深的特點(diǎn)，但是會(huì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的伴生危害產(chǎn)物2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。

4-甲基咪唑具有較強(qiáng)的驚厥作用，可以使動(dòng)物產(chǎn)生超興奮狀態(tài)從而發(fā)生痙攣[1]。2007年美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)規(guī)劃處（National Toxicology Program，NTP）將4-甲基咪唑作為可致癌物質(zhì)發(fā)出警告[2]，美國(guó)加州環(huán)境健康危害評(píng)估辦公室（OEHHA）2011年將4-甲基咪唑列入致癌化學(xué)品清單（the Proposition 65 list）中，并設(shè)定4-甲基咪唑的致癌潛能為0.024 （mg/kg bwday），無(wú)顯著風(fēng)險(xiǎn)水平（NSRL）為29 μg/d，要求超過(guò)該安全值的食品必須帶有警告性標(biāo)識(shí)[3]。2013年，世界癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）致癌物分級(jí)目錄將4-甲基咪唑、2-甲基咪唑列入2B級(jí)致癌物[4]。1-甲基咪唑與4-甲基咪唑、2-甲基咪唑互為同分異構(gòu)體，其毒理學(xué)性質(zhì)沒(méi)有得到充分的調(diào)查，但在部分食品中發(fā)現(xiàn)1-甲基咪唑的存在[5]。醬鹵肉制品是日常消費(fèi)量較大的食品，但是目前并沒(méi)有醬鹵肉制品中甲基咪唑類化合物含量的研究報(bào)道。GB 2760-2014中規(guī)定4類焦糖色均不能在醬鹵肉制品中使用[6]，醬鹵肉制品中的甲基咪唑類污染物可能來(lái)源于生產(chǎn)者非法添加了Ⅲ、Ⅳ類焦糖色，也可能來(lái)源于配料中醬油、醋等調(diào)味品的帶入。

目前報(bào)道食品中檢測(cè)的甲基咪唑類化合物多為2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，缺少1-甲基咪唑的檢測(cè)。檢測(cè)方法有分光光度法[7-8]、拉曼光譜法[9]、氣相色譜法[10-12]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]、高效液相色譜法[16-17]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[18-20]。分光光度法和氣相色譜法的前處理較為繁瑣[21-22]；拉曼光譜儀普及度較低；高效液相色譜法的靈敏度較低。本實(shí)驗(yàn)期望結(jié)合超高效液相色譜的快速分離能力以及質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度，建立一種快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的UPLC-MS/MS法測(cè)定醬鹵肉制品中的1-甲基咪唑、2甲基咪唑和4-甲基咪唑，填補(bǔ)醬鹵肉制品中甲基咪唑類化合物檢測(cè)的空白，為以后監(jiān)管部門的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和限值制定打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters Oasis MCX固相萃取小柱（150 mg，6 mL） 美國(guó)Waters公司；1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀、 6460C三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；Thermo Scientific HeraeusMlutifuge X3R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；IRM IDH30超聲儀 德國(guó)IRM Technology GmbH公司；IKA MS3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司；BiotageTurboVap全自動(dòng)氮吹儀 瑞典Biotage公司；HM100 POWTEQ刀式研磨儀 北京格瑞德曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取1-MEI、4-MEI標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL，混勻，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取10 μL 1-MEI、4-MEI標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液以及100 μL 2-MEI的標(biāo)準(zhǔn)品置10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確稱取1-MEI-D6、2-MEI-D6、4-MEI- D6標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，混勻，制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。再精密吸取10 μL 1-MEI-D6、2-MEI- D6、4-MEI- D6的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液置10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，制成1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混標(biāo)內(nèi)標(biāo)溶液適量，用初始流動(dòng)相稀釋成30、60、100、150、200、300、400 ng/mL混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中1-MEI-D6、2-MEI- D6、4-MEI- D6的濃度均為50 ng/mL。

1.2.2 供試品溶液的制備 取樣品約200 g，用刀式研磨儀充分均質(zhì)，裝入潔凈的容器中。

稱取上述均質(zhì)后的樣品2 g（精確至0.001 g），置50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，加水20 mL，渦旋1 min，再超聲（功率500 W）5 min，以10000 r/min在4 ℃條件下離心5 min，上清液待凈化。

凈化前，依次用5 mL甲醇，5 mL水對(duì)MCX固相萃取小柱進(jìn)行活化。再精密量取10 mL上清液，過(guò)MCX固相萃取小柱，依次用2%甲酸水溶液5 mL，甲醇5 mL淋洗，再用5%氨水甲醇溶液10 mL洗脫，收集全部洗脫液，45 ℃氮吹至近干，精密加入初始流動(dòng)相1 mL復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 分析條件 液相色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A相：乙腈；B相：5 mmol/L乙酸銨溶液；流速0.6 mL/min；流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：11 L/min。化合物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

“知識(shí)改變命運(yùn)”，這是現(xiàn)代人公認(rèn)的真理?？上У氖?，在懵懂的轉(zhuǎn)型時(shí)期，經(jīng)受著陣痛的人們對(duì)此并沒(méi)有清晰的認(rèn)知。在此情況下，他們既無(wú)法與伴侶進(jìn)行良好的溝通，更難以擺脫貧困潦倒的生存現(xiàn)實(shí)。因?yàn)椴幻骶屠?，即便有偶而的掙脫，也顯得蒼白無(wú)力。

表2 1-MEI、2-MEI、4-MEI、1-MEI-D6、2-MEI-D6、4-MEI-D6的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass parameters of 1-MEI, 2-MEI, 4-MEI,1-MEI-D6, 2-MEI-D6, 4-MEI-D6

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用美國(guó)Agilent Technologies Inc.的MassHunter Workstation Software 06.00軟件進(jìn)行分析處理，Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 1-MEI、2-MEI、4-MEI這3種化合物互為同分異構(gòu)體，具有相同的分子質(zhì)量和離子碎片，需要通過(guò)色譜柱實(shí)現(xiàn)完全分離后才能進(jìn)行檢測(cè)[23]。由于目標(biāo)化合物為含氮極性小分子化合物，采用常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱可能會(huì)出現(xiàn)保留差、出峰快、分離效果不佳的情況[24]。實(shí)驗(yàn)首先嘗試了Merck Purospher STAR LP RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm），3種化合物在填料為C18的色譜柱上無(wú)法達(dá)到很好的分離效果。實(shí)驗(yàn)又選擇了適合高極性化合物的HILIC填料的色譜柱進(jìn)行分離。分別比較了Thermo Acclaim Mix-Mode HILIC-1（2.1 mm×150 mm，3 μm）、Agilent Zorbax HILIC Plus（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent Poroshell 120 HILIC（2.1mm×100 mm，2.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）4種不同品牌和參數(shù)的HILIC色譜柱。最終選擇了Agilent Zorbax HILIC（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的很好分離（見(jiàn)圖1）。

圖1 醬鹵肉基質(zhì)中1-MEI, 2-MEI和4-MEI的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 1-MEI, 2-MEI and 4-MEI in sauced meat products

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 乙腈是HILIC色譜柱常用的有機(jī)流動(dòng)相，而在流動(dòng)相水相中加入緩沖鹽有利于提高色譜柱的柱效和重復(fù)性[25-26]。實(shí)驗(yàn)比較了不同梯度條件的乙腈-5 mmol/L的乙酸銨溶液。在表1的梯度條件下，目標(biāo)化合物可以達(dá)到一個(gè)很好的分離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取用1-MEI、2-MEI、4-MEI、1-MEI-D6、2-MEI-D6、4-MEI-D6標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。在ESI +模式下分別進(jìn)行全掃描，確定1-MEI、2-MEI、4-MEI的母離子均為m/z 83.1，對(duì)其母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描，3種待測(cè)化合物均分別丟失-C2H3和-NC2H3，相應(yīng)產(chǎn)生碎片離子m/z 56.1和m/z 42.1；在ESI+模式下分別進(jìn)行全掃描，1-MEI-D6、2-MEI-D6、4-MEI-D6均出現(xiàn)m/z 89.1和m/z 88.1兩個(gè)母離子峰，1-MEI-D6的m/z 89.1響應(yīng)高于m/z 88.1，實(shí)驗(yàn)選擇m/z 89.1作為1-MEID6的母離子；而2-MEI-D6和4-MEI-D6的m/z 88.1響應(yīng)高于m/z 89.1，實(shí)驗(yàn)選擇m/z 88.1作為2-MEI-D6和4-MEI-D6的母離子。對(duì)三種內(nèi)標(biāo)化合物的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描，分別產(chǎn)生碎片離子m/z 61.1、m/z 60.1、m/z 44.1，作為內(nèi)標(biāo)化合物的定量離子。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)3種甲基咪唑類化合物物理和化學(xué)性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)采用添加水平為50 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)考察條件做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)（n=6）?？疾焖⒓状?、乙腈3種提取溶劑的提取能力，以加標(biāo)回收率考察提取效果（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，1-MEI：水＞乙腈＞甲醇；4-MEI：水＞甲醇＞乙腈；2-MEI：水與甲醇效果相似，均明顯優(yōu)于乙腈。綜上，同時(shí)考慮成本、環(huán)保等因素，選擇水為提取溶劑。

圖2 提取溶劑的考察（n=6）Fig.2 Research of extraction solvents（n=6）

2.3.2 固相萃取小柱的選擇 甲基咪唑類化合物由于其分子中含有氮原子，凈化時(shí)宜采用對(duì)堿性物質(zhì)有較好保留的陽(yáng)離子交換固相萃取柱[27]。因此實(shí)驗(yàn)比較了市面上常見(jiàn)的兩種品牌的陽(yáng)離子交換固相萃取小柱，分別為Waters Oasis MCX（150 mg，6 mL）和Agela Cleanert PCX（150 mg，6 mL）。采用添加水平為50 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（n=6），以加標(biāo)回收率考察兩個(gè)小柱的凈化效果（見(jiàn)圖3）。結(jié)果表明Waters Oasis MCX凈化效果略優(yōu)于Agela Cleanert PCX。

圖3 固相萃取小柱的考察（n=6）Fig.3 Research of solid phase extraction colum（n=6）

2.3.3 固相萃取條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)采用添加水平為50 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（n=6），以加標(biāo)回收率考察了不同濃度的氨水-甲醇溶液對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力，分別考察了2%、5%、10%、20%的氨水-甲醇溶液（見(jiàn)圖4）。四種溶液對(duì)2-MEI、4-MEI的洗脫效果無(wú)明顯差異，其中1-MEI洗脫受氨水濃度的影響稍大，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，選擇5%氨水-甲醇溶液作為洗脫溶劑。

圖4 MCX固相萃取小柱洗脫溶劑的考察（n=6）Fig.4 Research of the elution solvent on MCX solid phase extraction column（n=6）

實(shí)驗(yàn)考察了不同體積的洗脫溶劑的對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力。分別考察了5、10、15 mL的洗脫溶劑用量，以加標(biāo)回收率考察不同用量洗脫溶劑的洗脫效果（見(jiàn)圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用10 mL及15 mL洗脫溶劑的洗脫效果接近，均優(yōu)于5 mL的洗脫效果。綜合洗脫效果、成本及環(huán)保等因素，選擇10 mL作為洗脫體積。

圖5 MCX固相萃取小柱洗脫溶劑體積的考察（n=6）Fig.5 Research of the volume of the elution solvent（n=6）

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取后添加法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect, ME），將空白樣品按前處理方法進(jìn)行提取凈化后，在空白樣品提取液中添加目標(biāo)化合物，用已定的色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，然后與同樣濃度的純?nèi)軇┲心繕?biāo)化合物的離子響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行比較。采用公式：其中A和B分別表示純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中分析物的離子響應(yīng)強(qiáng)度。若ME＜1，說(shuō)明基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用；ME＞1，說(shuō)明基質(zhì)會(huì)增強(qiáng)分析物的響應(yīng)；ME=1，說(shuō)明不存在基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了三個(gè)濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)（30、200、400 ng/mL）,1-MEI三個(gè)濃度水平下的ME分別為0.65、0.55、0.57；2-MEI三個(gè)濃度水平下的的ME分別為0.78、0.74、0.77；4-MEI三個(gè)濃度水平下的的ME分別為0.54、0.57、0.58.結(jié)果說(shuō)明基質(zhì)對(duì)3種咪唑類化合物均有程度不一的抑制作用。實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證定量的準(zhǔn)確性[28-29]。

2.4.2 線性范圍、檢出限和定量限 用初始流動(dòng)相配制1-MEI、2-MEI和4-MEI的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為30、60、100、150、200、300、400 ng/mL。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)化合物定量離子的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)得到線性回歸方程（見(jiàn)表3），3種甲基咪唑化合物線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9997。通過(guò)空白樣品加標(biāo)測(cè)定，3種甲基咪唑類化合物在10 μg/kg的添加水平下經(jīng)過(guò)前處理所得試液的定性離子信噪比（S/N）均大于3，表明該方法的3種甲基咪唑類化合物的檢出限均可達(dá)到10 μg/kg；3種甲基咪唑類化合物在30 μg/kg的添加水平下經(jīng)過(guò)前處理所得試液的定性離子信噪比（S/N）均大于10，且1-MEI、2-MEI和4-MEI的回收率分別為106.0%、100.6%、92.0%，表明該方法3種化合物的定量限均可達(dá)到30 μg/kg。

表3 1-MEI、2-MEI和4-MEI的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, limits of detection (LOD) and limits of quantitation(LOQ) of 1-MEI, 2-MEI and 4-MEI

2.4.3 回收率、精密度和穩(wěn)定性 選取醬鹵肉樣品中添加30、60、300 μg/kg三個(gè)水平，每個(gè)水平分別做6份平行樣，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。3種甲基咪唑類化合物三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為92.0%～116.3%，RSD為0.70%～3.96%。樣品加標(biāo)溶液分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，3種甲基咪唑類化合物的定量離子峰面積RSD為2.69%～4.41%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

2.4.4 實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作驗(yàn)證 為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇了6家檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證。6家檢測(cè)機(jī)構(gòu)的結(jié)果顯示，3種甲基咪唑類化合物在30～400 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9990；方法檢出限濃度下的定性離子信噪比均大于3；方法定量限濃度下的定性離子信噪比均大于10。30、60、300 μg/kg三個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為77.2%～115.2%，RSD為0.80%～9.34%。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的36批次醬鹵肉樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36批次樣品均檢出4-MEI，含量為3.1～306.6 μg/kg；2批次樣品檢出2-MEI，含量為21.4～23.6 μg/kg；36批次樣品均未檢出1-MEI。從結(jié)果分析，醬鹵肉制品中可能存在超范圍使用Ⅲ、Ⅳ類焦糖色的情況，也可能是由其配料帶入，例如，醬油、醋等，需要結(jié)合其生產(chǎn)工藝進(jìn)行綜合分析。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了醬鹵肉制品中3種甲基咪唑類化合物測(cè)定的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，樣品經(jīng)水提取，MCX固相萃取柱凈化后上機(jī)檢測(cè)。方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能一次性測(cè)定醬鹵肉制品中3種甲基咪唑類化合物，可以滿足監(jiān)管需要，為以后醬鹵肉制品中甲基咪唑類化合物分析測(cè)定以及相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了重要參考價(jià)值。