慢性乙型肝炎患者Toll樣受體2與乙型肝炎病毒DNA表達(dá)水平相關(guān)性研究

楊麗娟，郝小康，周 軍

(1.安康市人民醫(yī)院檢驗科，陜西 安康 725000；2.西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 咸陽 712082)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)發(fā)生的根本性原因，也是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。我國約有HBV攜帶者9300萬例，其中CHB患者2000萬例，是肝硬化、肝功能失代償、肝癌發(fā)生的主要危險因素，早期診治可及時阻斷病情，改善患者預(yù)后[2-3]。特別是很多CHB患者機(jī)體免疫功能低下，不能產(chǎn)生有效的針對HBV的特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，使HBV得以不斷復(fù)制增殖，導(dǎo)致HBV感染持續(xù)化，形成惡性循環(huán)[4-5]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是在機(jī)體免疫性發(fā)揮重要作用的一類模式識別受體(PRR)家族分子，具有高度保守的分子結(jié)構(gòu)，可被非特異性免疫細(xì)胞識別[6-7]。在病毒性肝炎中，TLRs與配體結(jié)合后可經(jīng)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘導(dǎo)特異性靶細(xì)胞基因的表達(dá)，從而抑制機(jī)體的病毒復(fù)制，介導(dǎo)修復(fù)機(jī)體的肝損傷[8-10]。本研究探討CHB患者HBV-DNA水平與TLR2表達(dá)的相關(guān)性，以明確CHB發(fā)生機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年8月到2020年10月在本院診治的CHB患者123例作為肝炎組，選擇同期的健康體檢者123例作為對照組。兩組一般資料對比無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)，見表1。肝炎組納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程≥6個月；HBV-DNA檢測陽性；年齡25～75歲；患者均知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠與哺乳期婦女；藥物、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎及其他病毒性肝炎感染者；不能合作者；臨床資料缺乏者；嚴(yán)重心、肺、腦、腎等重要臟器功能障礙者。

表1 兩組一般資料對比

1.2 HBV-DNA水平與TLR2相對表達(dá)檢測 抽取所有入選者空腹靜脈血2～3 ml，肝素鈉抗凝30 min，3000 r/min離心15 min。取全血組織提取淋巴細(xì)胞，分離單個核細(xì)胞。提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR條件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20s持續(xù)40個循環(huán)，40 ℃ 10 s。TLR2正向引物為5’-GGGAACATCCAAGGCAAG-3’，反向引物為5’-AGCTCATCTAGCACCTCACT-3’。同時檢測HBV-DNA水平。

1.3 肝功能指標(biāo)檢測與病理分級 調(diào)查所有入選者一般資料，記錄肝功能指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)等]水平。對肝炎組患者進(jìn)行肝臟炎癥病理分級：①匯管區(qū)及周圍無炎癥，小葉內(nèi)無炎癥，為G0級；②匯管區(qū)及周圍炎癥，小葉內(nèi)變性及少數(shù)點(diǎn)狀壞死，為G1級；③匯管區(qū)及周圍輕度碎屑樣壞死，小葉內(nèi)可見嗜酸小體，為G2級；④匯管區(qū)及周圍中度碎屑樣壞死，小葉內(nèi)可見變性、融合壞死，為G3級；⑤匯管區(qū)及周圍重度碎屑樣壞死，累及多小葉壞死，為G4級。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.00統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對比采用t檢驗。計數(shù)資料對比采用卡方檢驗。相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson法。影響CHB患者HBV-DNA水平的因素采用Logistic回歸分析。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 兩組HBV-DNA與TLR2相對表達(dá)水平比較 對照組未檢出HBV-DNA，肝炎組HBV-DNA<103IU/ml 45例，103～106IU/ml 55例，>106IU/ml 23例。肝炎組TLR2相對表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組TLR2相對表達(dá)水平比較

2.2 肝炎組患者炎癥病理分級 在肝炎組炎癥病理分級中，G0級56例，G1級24例，G2級20例，G3級13例，G4級10例。

2.3 兩組常規(guī)肝功能指標(biāo)比較 見表3。肝炎組血清ALT、AST、AFP、GGT與ALP高于對照組(均P<0.05)。

表3 兩組常規(guī)肝功能指標(biāo)比較

2.4 CHB患者HBV-DNA與TLR2等指標(biāo)相關(guān)性分析 見表4。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HBV-DNA水平與TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級、ALP存在相關(guān)性(均P<0.05)。

表4 CHB患者HBV-DNA與TLR2等指標(biāo)相關(guān)性

2.5 CHB患者HBV-DNA水平影響因素分析 見表5。在123例患者中，以HBV-DNA水平作為因變量，以TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級均為CHB患者HBV-DNA水平的影響因素(均P<0.05)。

表5 CHB患者HBV-DNA水平影響因素分析

3 討 論

CHB為臨床上比較常見的傳染性疾病，是肝細(xì)胞癌、肝硬化、肝功能失代償發(fā)生的重要病因[11]。其具體發(fā)生機(jī)制，目前還不明確，一些學(xué)者認(rèn)為宿主免疫系統(tǒng)與HBV-DNA相互作用是重要原因，特別是體內(nèi)HBV-DNA的感染與清除以及相關(guān)肝臟損傷情況往往取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)[12-13]。本研究顯示對照組未檢出HBV-DNA，肝炎組均檢出HBV-DNA，且肝炎組TLR2相對表達(dá)水平也高于對照組。TLR在觸發(fā)先天免疫抗病毒過程中起關(guān)鍵作用，HBV-DNA反過來也可以通過抑制TLR等激活而抑制宿主防御，抵抗機(jī)體對病毒的清除[14]。TLR2屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成[15]。胞質(zhì)區(qū)為Toll/白細(xì)胞介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的區(qū)域，胞外區(qū)是由串聯(lián)的富含亮氨酸的重復(fù)基序形成的亮氨酸結(jié)構(gòu)域[16]。胞質(zhì)區(qū)與白介素-1受體家族高度同源，負(fù)責(zé)與細(xì)胞內(nèi)含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子相互作用，調(diào)節(jié)下游信號級聯(lián)反應(yīng)[17]。TLR2主要分布于細(xì)胞膜上，可以識別胞質(zhì)中的雙鏈RNA(dsRNA)，再通過銜接蛋白啟動特異性信號通路，從而激活促炎癥細(xì)胞因子基因，介導(dǎo)抗病毒效應(yīng)。相關(guān)研究顯示，巨噬細(xì)胞上TLR2下游通路可以被HBV-DNA干擾，導(dǎo)致炎癥因子分泌受到抑制，從而使抗病毒免疫能力受到影響。TLR2不僅在肝炎和肝纖維化時表達(dá)水平升高，而且在肝癌組織中也有持續(xù)表達(dá)[18]。下調(diào)或沉默TLR2則可明顯降低化學(xué)誘導(dǎo)肝炎的發(fā)生率，上調(diào)TLR2可促進(jìn)相關(guān)炎癥因子等的釋放[19]。

CHB的發(fā)生是一個復(fù)雜過程，涉及許多腫瘤標(biāo)志物與基因在不同節(jié)點(diǎn)的表達(dá)[20]。本研究顯示肝炎組血清ALT、AST、AFP、GGT與ALP值高于對照組，不過這些指標(biāo)的特異性不強(qiáng)，很難單獨(dú)反映CHB病情進(jìn)展情況，為此在臨床上還需要尋找能夠完全滿足臨床診斷的可靠標(biāo)記物。

細(xì)胞免疫應(yīng)答(包括輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答)在機(jī)體清除HBV-DNA過程中起重要作用[21]。TLR2能識別dsRNA，活化MyD88非依賴信號通路，激活促炎癥因子及Ⅰ型干擾素基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)抗病毒效應(yīng)[22]。本研究Pearson相關(guān)性分析顯示CHB患者HBV-DNA水平與TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級、ALP均存在相關(guān)性；Logistic回歸分析顯示TLR2、ALT、AST、AFP、肝臟炎癥病理分級均為CHB患者HBV-DNA水平的影響因素。TLR2可調(diào)控先天和獲得性免疫，在HBV感染及繼發(fā)肝臟炎癥損傷過程中起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，CHB患者多伴有TLR2高表達(dá)，與HBV-DNA水平呈正相關(guān)，是影響CHB患者病情與肝功能的重要指標(biāo)。但限于患者數(shù)量少及收集時間較短等原因，本研究可能存在一定偏倚，后續(xù)將進(jìn)行更為深入的研究。