乙型肝炎病毒S基因不同區(qū)域嵌合丙型肝炎病毒中和抗原表位病毒樣顆粒實驗研究

舒 放，王海峰，薛飛肖，呂海港

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710018；2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710054)

目前全球丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染者約7100萬人，慢性感染導(dǎo)致肝硬化和肝癌，甚至危及生命。近年來因受感染人口老齡化、口服抗病毒療法廣泛應(yīng)用等原因，全球HCV流行率快速下降[1]，但某些國家和地區(qū)注射毒品流行的增加在某種程度上部分抵消了這一下降，導(dǎo)致新的HCV感染增加[2-5]，僅靠治療仍不足以實現(xiàn)HCV感染的消除。由于獲得治療的機會有限、費用較高、耐藥性、治愈后再感染等情況的存在，迫切需要制定預(yù)防HCV感染的有效措施，尤其是研發(fā)出廣譜有效的疫苗來阻止全球HCV傳播[6-7]?，F(xiàn)有研究[8-10]表明疫苗在機體細胞免疫及體液免疫反應(yīng)中能夠表現(xiàn)出持久性的抗病毒作用。在控制和預(yù)防傳染病方面，疫苗仍然是最具成本效益和最成功的干預(yù)措施[11]。病毒樣顆粒(Virus like particle，VLP)是不含病毒遺傳物質(zhì)顆粒，形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒相似的能自我裝配的病毒空殼，因此不具備感染性，但具有很強的免疫原性和生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于疫苗研究領(lǐng)域[12-13]。本研究利用乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)S基因具有裝配VLP的特性，在其親水區(qū)和氨基端區(qū)插入HCV串聯(lián)中和表位抗原，通過定量測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)比較純化濃縮后的VLP含量，為后期HCV VLP疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 真核載體pCI-neo、重組質(zhì)粒pCI-HBS、pCI-NEmS、人胚胎腎細胞293T(HEK293T細胞)由唐都醫(yī)院韋三華教授惠贈；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購于Gibco;Lipofectamine 2000?轉(zhuǎn)染試劑購于Invivogen；重組乙型肝炎疫苗購于GlaxoSmithKline Biologicals;Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器購于Millipore;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶AgeⅠ購于Thermo公司。

1.2 串聯(lián)HCV中和抗原表位合成 根據(jù)前期研究選擇了一個 HCV E1 基因區(qū)保守的中和表位[ITGHRMAWDMMMNWS(氨基酸序列313～327位)]、兩個E2區(qū)具有廣譜交叉活性的中和表位[QLINTNGSWHIN(412～423)和GVPTYSWGENETD(523～535)]以及一個HVR1的模擬表位(ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK)。四者之間用 AAY連接，進行PCR擴增構(gòu)建串聯(lián)多中和表位序列Em，兩端引入AgeⅠ酶切位點ACCGGT。

1.3 串聯(lián)HCV中和抗原表位嵌合入HBV S基因親水區(qū) pCI-HBS為親水區(qū)aa127～128位引入AgeⅠ酶切位點的重組質(zhì)粒，酶切體系中加入pCI-HBS 10 μl，10×緩沖液 0 2 μl，AgeⅠ酶2 μl，ddH2O 6 μl，37 ℃ 4 h進行酶切。電泳后回收膠，純化至10 μl。將回收純化的pCI-HBS與Em進行連接，5×緩沖液2 μl，pCI-HBS 2 μl，Em基因5 μl，T4連接酶1 μl，16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選正確克隆，擴增后提取質(zhì)粒，送測序后保留插入方向正確的質(zhì)粒，命名為pCI-S1EmS2。

1.4 制備VLP-NEmS和VLP-S1EmS2 HEK293T細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中(雙抗)。細胞生長至密度80%時，用脂質(zhì)體法將pCI-S1EmS2和pCI-NEmS轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，48 h后收集培養(yǎng)上清，2000 r/min離心15 min，除去細胞碎片等雜質(zhì)，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，分別命名為VLP-NEmS和VLP-S1EmS2。

1.5 VLP濃縮及純化 將1.4中VLP-NEmS和VLP-S1EmS2分別鋪于9種濃度梯度的蔗糖溶液(20%～60%)上，置于Beckman超速離心機(Rotor SW41)28000 r/min超速離心16 h。從管底依次收集不同濃度層，每個濃度層取10 μl生理鹽水稀釋至200 μl，在羅氏E601電化學(xué)發(fā)光分析儀上對每個濃度層HBsAg臨界指數(shù)(Cut off index，COI)進行測定，收集濃度最高的濃度層。用節(jié)流分子量8000～10000的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl(8.0)中透析，48 h后將透析好的樣品經(jīng)0.22 μm濾器除菌，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，得到純化、濃縮的VLP，-80 ℃凍存。

1.6 VLP定量測定 通過10次獨立實驗重復(fù)1.4、1.5實驗步驟，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)過濃縮、純化制備病毒樣顆粒VLP-NEmS以及VLP-S1EmS2。電化學(xué)發(fā)光法對兩種VLP進行HBsAg定量檢測，VLP-HBS及乙肝疫苗(HBsAg濃度為20×103ng/ml)作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 HBV S基因及串聯(lián)中和表位序列Em擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1。將HBV S基因及串聯(lián)多中和表位序列Em擴增產(chǎn)物加樣至1%瓊脂糖凝膠(0.5 μl/ml溴化乙啶)進行電泳，可見681 bp及255 bp擴增片段，與預(yù)期相符。

M：DNA Marker 2000；1：HBV S基因擴增產(chǎn)物；2：串聯(lián)中和表位序列Em擴增產(chǎn)物

2.2 VLP-NEmS和VLP-S1EmS2蔗糖密度梯度離心結(jié)果 見圖2。分別收集1 ml/管的9層分離片段進行HBsAg定量測定，結(jié)果在6號濃度(即45%濃度)蔗糖溶液中收集到的2種VLP濃度最高。

注：1～9號分別代表質(zhì)量體積百分比濃度為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%蔗糖溶液

2.3 透析、濃縮后VLP濃度比較 見圖3。重復(fù)轉(zhuǎn)染、純化、濃縮制備VLP的過程，對10次獨立實驗的均值結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。VLP-NEmS、VLP-S1EmS2和非嵌合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的VLP-HBS HBsAg均值分別為(5.83±0.53)×103ng/ml、(1.81±0.76)×103ng/ml和(6.27±0.47)×103ng/ml，其中VLP-S1EmS2低于VLP-HBS(t=16.83，P<0.05)，而VLP-NEmS與VLP-HBS均值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.542，P=0.157)。因此，HCV串聯(lián)中和抗原表位嵌合于HBV S基因氨基端胞外區(qū)形成的病毒樣顆粒包裝效率高于親水區(qū)。

注：與VLP-HBS比較，*P<0.05

3 討 論

傳統(tǒng)的疫苗研究直到20世紀80年代仍主要基于減毒或滅活病毒，在誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生有效T細胞及B細胞免疫應(yīng)答中顯示出良好功效，并能產(chǎn)生持久的免疫力[14]。主要歸因于減毒病毒應(yīng)答能力、表面幾何形態(tài)重復(fù)性、顆粒特性、刺激產(chǎn)生先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)能力等幾個關(guān)鍵特性[15]，但是傳統(tǒng)疫苗在生產(chǎn)效能及對免疫缺陷患者安全性方面有其自身缺陷，因此人們需要尋找新的疫苗研發(fā)替代方案。

VLP疫苗具有大多數(shù)傳統(tǒng)疫苗的特性，由于缺少病毒基因組而無法復(fù)制，因此作為疫苗開發(fā)的安全性得以保證。大多數(shù)VLP外殼由幾個相同蛋白質(zhì)拷貝構(gòu)成，形成二十面體或螺旋(棒狀)結(jié)構(gòu)[16]。絕大多數(shù)VLP直徑在20～100 nm，這使得其能夠自由進入淋巴管到達被膜下淋巴結(jié)并選擇性地被抗原提呈細胞所攝取[17]。許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白都具有自主組裝成VLP的能力。VLP可以在170多種不同表達宿主系統(tǒng)中產(chǎn)生，包括細菌、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞以及植物細胞，某種程度上反映了VLP宿主譜的廣泛性。HBV S基因在沒有核心蛋白和基因組的參與下能夠自我裝配，在宿主細胞中產(chǎn)生VLP并分泌至培養(yǎng)上清中，因其可以攜帶外源性蛋白，易于制備及純化，能增強外源性蛋白免疫原性，是公認的較好表達載體。使用異源表達系統(tǒng)甚至可以獲得三聚體的復(fù)雜表位，如人類免疫缺陷病毒(HIV-1型)包膜糖蛋白[18]和流感病毒血凝素[19]的三聚體。

我們根據(jù)之前的研究，選取3個HCV抗原表位基因進行串聯(lián)，分別嵌合于HBV S基因親水區(qū)及氨基端胞外區(qū)，構(gòu)建串聯(lián)嵌合基因的重組表達載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，在培養(yǎng)液上清中分別收集VLP。經(jīng)過濃縮及純化，以定量測定HBsAg的方法比較各種VLP濃度，反映HBV S基因不同區(qū)域嵌合HCV中和抗原表位表達載體生成VLP的效率。在之前的研究[20]中，我們將不同片段HCV抗原表位分別嵌合在HBV S基因親水區(qū)同一位置，并對其VLP形成情況進行分析，經(jīng)濃縮、純化后，幾種VLP能夠與商品化的乙肝疫苗在HBsAg含量上達到同一數(shù)量級，但由于插入片段表位性質(zhì)及長短不同，收集的幾種VLP相比其濃度存在差異，主要表現(xiàn)為HBV S基因親水區(qū)插入的HCV表位序列越長，形成VLP的能力越弱。但理論上嵌合的HCV表位越長，涉及的抗原譜越廣，疫苗產(chǎn)生的有效應(yīng)答概率越大，所以在質(zhì)和量上產(chǎn)生了矛盾。為了驗證插入表位氨基酸數(shù)量及位置對包裝VLP的影響，我們將3種HCV表位串聯(lián)形成較長的片段，分別嵌合在HBV S基因親水區(qū)及氨基端胞外區(qū)，構(gòu)建表達載體PCI-NEmS與PCI-S1EmS2，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細胞，在細胞培養(yǎng)上清中收集嵌合病毒樣顆粒VLP-NEmS與VLP-S1EmS2，經(jīng)過多輪重復(fù)實驗分析嵌合方式對于VLP形成的影響。從HBsAg含量測定結(jié)果來看，胞外區(qū)嵌合VLP-NEmS與親水區(qū)VLP-S1EmS2濃度結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，胞外區(qū)含量較高。

綜上所述，HCV中和表位嵌合位置不同造成病毒樣顆粒的包裝能力差異，嵌合于胞外區(qū)氨基端比嵌合于親水區(qū)能夠更有效率地包裝出病毒樣顆粒，成為疫苗研發(fā)中可以參考的一種策略。本實驗制備的VLP與商品化的乙肝疫苗達到相同數(shù)量級，能夠滿足后續(xù)HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)及免疫動物評價中和抗體的實驗要求，為誘導(dǎo)廣譜交叉保護作用中和抗體的HCV疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。然而，本研究雖然證明HCV串聯(lián)中和表位嵌合在HBV S基因氨基端胞外區(qū)比親水區(qū)包裝出的VLP效率高，但嵌合于HBV S基因不同部位是否能夠刺激機體產(chǎn)生相同、有效的中和抗體水平以及交叉保護作用仍需要通過動物模型及中和抗體評價系統(tǒng)做進一步的研究。