紅景天苷通過抑制線粒體自噬通路減輕1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡實驗研究

王松海，康 超，謝燕華，陳 捷，劉 楠

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，陜西 西安 710003)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種發(fā)生于中老年人的常見神經(jīng)退行性運動功能障礙疾病。其病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元退行性變性丟失，紋狀體區(qū)DA含量減少，以及殘存的DA能神經(jīng)元內(nèi)形成以α-突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體——路易小體[1-2]。在北京大于 65 歲的人群中，男性患病率為1.7%，女性為1.6%[3]，基本與發(fā)達國家相同。目前臨床治療中主要是對癥治療，而減輕或抑制發(fā)病過程的藥物尚未被發(fā)現(xiàn)。雖然流行病學(xué)對于PD的具體發(fā)病機制尚未清楚，但是線粒體功能障礙以及DA能神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激刺激被認為是引起該病的主要原因。近年來，中醫(yī)藥在神經(jīng)退行性變中的應(yīng)用，尤其是植物藥對PD的神經(jīng)保護作用，受到人們的廣泛關(guān)注。紅景天作為一個有價值的藥用植物，我國自古就有將紅景天用于煎湯或泡酒，作為補品或治療疾病的藥物使用的記錄，以消除疲勞或抵御寒冷。紅景天苷(Salidroside，Sal)主要是從紅景天的根、塊莖中提取出來的，具有較強的神經(jīng)保護作用[4-8]。我們前期研究表明Sal具有抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的作用，而其主要機制與減少細胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)[9-10]。同時，我們還發(fā)現(xiàn)Sal對神經(jīng)細胞的保護作用可能與抑制線粒體的破壞有關(guān)。因此，本研究將進一步探討Sal對PD體外模型的神經(jīng)保護作用機制，為研究Sal的治療作用提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PC12細胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)實驗中心提供；Sal(HPLC 法檢測純度>98%，CAS：82373-94-2)購自四川維克奇生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清購自Gibco公司。MPP+(CAS：D048-100MG)、4-甲基偶氮唑藍(MTT，CAS：298-93-1)、Annexin V-binding/PI-uptake(CAS：APOAF-20TST)、羅丹明123(CAS：62669-70-9)購自Sigma公司；兔抗大鼠PINK1、Parkin、LC-3、Beclin1抗體(一抗，ab216144、ab15494、ab48394、ab207612)以及β-actin抗體(一抗，ab8227)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG的抗體(二抗，ZB-20301)購自北京中杉公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：PC12細胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%馬血清、5%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 kU/L青霉素、100 g/L鏈霉素)中，置于含5% CO2的37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。隔天換液，待單層細胞融合約80%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。當傳代細胞進入對數(shù)生長期時進行實驗處理。

1.2.2 實驗分組：根據(jù)實驗需求分為四組。對照組：不加任何實驗受試物。單純藥物組：在對照組的基礎(chǔ)上加入100 μmol/L Sal。MPP+模型組：MPP+用培養(yǎng)液稀釋(終濃度為500 μmol/L)，加入到培養(yǎng)孔中。不同劑量 Sal組：先分別加入終濃度為10、100 μmol/L的Sal，孵育24 h后加入MPP+，每組樣本量為6～8個。

1.2.3 細胞活性檢測：基于MTT在活細胞線粒體脫氫酶作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)樗{紫色甲瓚結(jié)晶進行檢測。PC12細胞接種于96孔板，接種密度為1×105個/孔，每孔100 μl培養(yǎng)液。按實驗要求進行藥物干預(yù)后，吸盡培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μl，37 ℃下繼續(xù)孵育3～4 h。小心去除培養(yǎng)液后，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，使藍色結(jié)晶充分溶解，上酶標儀，以波長490 nm檢測每孔吸光度值。細胞活性以與對照組相比的百分數(shù)表示。實驗均重復(fù)3次。

1.2.4 凋亡細胞檢測：用流式細胞儀Annexin V-binding和PI-uptake進行定量檢測。用MPP+和(或)Sal處理后，將細胞通過離心收集，PBS沖洗，再以1×106個/ml的濃度懸浮于結(jié)合緩沖液中。加入5 μl 20 μg/ml Annexin V-FITC和10 μl 50 μg/ml PI，在室溫下孵育15 min，避光。然后使用流式細胞儀進行細胞凋亡水平的定量分析。凋亡細胞以占總細胞數(shù)的百分比表示。實驗均重復(fù)3次。

1.2.5 線粒體膜電位檢測：按常規(guī)方法提取線粒體，用適量1×Assays Buffer重懸。常規(guī)方法進行蛋白含量測定后，用1×Assays Buffer調(diào)配成3 mg/ml的線粒體溶液。取2 ml 1×Assays Buffer和1 ml線粒體溶液，加入適量待測化合物(同時設(shè)空白對照組)，25 ℃保溫5 min。加入羅丹明123染液10 μl，進行熒光光度計檢測，測得的熒光值以與對照組細胞熒光度的百分比表示。實驗均重復(fù)3次。

1.2.6 蛋白表達情況檢測：采用Western blot檢測LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin、β-Actin蛋白表達情況。提取的蛋白質(zhì)先經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，再取20 μg蛋白樣本進行Western blot檢測，后進行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。結(jié)果采用凝膠圖像分析儀進行灰度分析。實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 Sal與MPP+對PC12細胞活性的影響 見圖1。通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，單純Sal對PC12細胞活性未見明顯影響。MPP+具有劑量依賴性減少PC12細胞活力的作用，500 μmol/L MPP+處理24 h后，細胞活力顯著下降至(52.4±2.2)%，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。因此，將500 μmol/L MPP+處理24 h作為模型組。不同濃度Sal(10、100 μmol/L)預(yù)處理24 h后，細胞活力分別恢復(fù)至(63.1±2.1)%和(84.1±1.3)%，與MPP+模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MPP+模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 Sal與MPP+對PC12細胞凋亡的影響 見圖2。MPP+預(yù)處理后，凋亡細胞百分比從(2.26±0.13)%增加至(58.54±2.23)%，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。而在10、100 μmol/L Sal預(yù)處理后，細胞凋亡比例分別降至(39.13±1.45)%和(20.32±2.21)%，與MPP+模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；

2.3 Sal與MPP+對PC12細胞線粒體膜電位(MMP)的影響 見圖3。500 μmol/L MPP+處理PC12細胞后，羅丹明123信號降低至(48.64±2.34)%，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。而在10、100 μmol/L Sal處理后，MMP峰值分別升至(62.14±2.32)%和(86.31±2.35)%，與MPP+模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與

2.4 Sal與MPP+對PC12細胞中相關(guān)蛋白表達的影響 見圖4。 與對照組相比，MPP+處理后細胞內(nèi)LC-3β、Beclin1表達增多，PINK1、Parkin表達減少(均P<0.01)。Sal預(yù)處理后，與MPP+模型組比較，細胞內(nèi)LC-3β、Beclin1蛋白表達水平明顯下降，而PINK1、Parkin蛋白表達水平明顯上升(均P<0.05)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與MPP+模型組比較，#P<0.05

3 討 論

帕金森病1817年由Parkinson首次發(fā)現(xiàn)，目前是臨床上老年人常見的神經(jīng)退行性疾病。我國PD患病率高達1.7%，目前已嚴重影響國民生活質(zhì)量。雖然PD治療取得了一系列的成就，但其發(fā)病機制迄今仍不清楚，因為沒有一種學(xué)說可以解釋PD患者所有的臨床癥狀。一般隨著病程延長，PD臨床癥狀經(jīng)歷由少至多、由輕至重的復(fù)雜變化。PD臨床癥狀主要分為以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、言語不利、平衡障礙為主的運動癥狀，和以認知功能障礙、感覺異常、自主神經(jīng)功能障礙、睡眠障礙為主的非運動癥狀[11-12]。PD通常在臨床癥狀明顯及確診之前，可能都伴有神經(jīng)退行性病變，但目前主要的DA治療并不能完全逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的凋亡，也不能徹底抑制PD病理改變，只能緩解其部分運動癥狀，而對一些非運動癥狀如焦慮、抑郁等無影響，甚至?xí)又乇忝亍⒌脱獕?、幻視等癥狀。因此，對于PD的機制研究越來越多受到關(guān)注，希望能從源頭尋找到徹底解決問題的方案[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，PD的發(fā)病原因不能僅僅依靠基因?qū)W說完全解釋，因為PD病例中大多數(shù)(≥95%)是散發(fā)的。總體來看，PD發(fā)病機制目前主要有運動神經(jīng)元異常凋亡學(xué)說、線粒體功能障礙學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激學(xué)說、免疫炎癥反應(yīng)學(xué)說、微生物-腸-腦軸調(diào)控機制學(xué)說、鐵死亡調(diào)控機制學(xué)說等[15-19]。每一個學(xué)說都只能解釋部分PD的發(fā)病現(xiàn)象，但PD發(fā)病中仍然有一些共同的生化病理特征，如殘存神經(jīng)元細胞內(nèi)以α-突觸核蛋白的大量聚集等。

研究表明Sal具有明顯抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激激活的作用，我們前期體外研究結(jié)果也表明Sal具有激活細胞內(nèi)異常蛋白聚集清除系統(tǒng)(泛素蛋白酶系統(tǒng))的作用，但進一步提高抗氧化物濃度并不能完全阻止多巴胺能神經(jīng)元的損傷。有研究[20]在這些損傷的神經(jīng)元細胞中發(fā)現(xiàn)存在線粒體功能障礙，其中有Caspase通路、泛素蛋白酶系統(tǒng)、自噬系統(tǒng)的激活。線粒體的功能障礙與活性氧生成以及能量增加密切相關(guān)，而PD患者黑質(zhì)中線粒體復(fù)合物Ⅰ活性降低32%～38%，導(dǎo)致細胞有氧呼吸功能減弱，發(fā)生酸中毒及氧化應(yīng)激。而氧化應(yīng)激又將導(dǎo)致線粒體膜受損，引起膜電位去極化，使得細胞膜上PINK1蛋白被激活，激活后的PINK1蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體外膜，誘導(dǎo)下游Parkin在線粒體外膜聚集[21-22]。Parkin在線粒體外膜的聚集可以加強線粒體的分裂，從而有利于受損傷的線粒體被清除。同時，Parkin移位到線粒體后E3泛素連接酶的活性增加，引起多種線粒體底物泛素化，從而導(dǎo)致受損的線粒體被清除。Parkin介導(dǎo)線粒體泛素化后，泛素結(jié)合接頭蛋白P62既可與線粒體底物結(jié)合，又可與LC-3、Beclin1結(jié)合介導(dǎo)泛素化線粒體進入自噬體，然后通過自噬體與溶酶體融合清除受損線粒體[23-24]。因此，對于Sal是否參與損傷細胞器的自動降解途徑(自噬系統(tǒng))，PD中多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)線粒體損傷是否與自噬相關(guān)，仍需我們進一步研究。

本研究采用MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞模擬PD體外模型，經(jīng) Sal預(yù)處理后細胞活性明顯好轉(zhuǎn)，凋亡情況明顯改善。進一步研究發(fā)現(xiàn)模型組細胞內(nèi)MMP水平明顯降低，LC-3β、Beclin1表達增多，PINK1、Parkin表達減少，而經(jīng)Sal預(yù)處理后上述損傷均可以明顯改善。

綜上所述，Sal對PD模型中DA能神經(jīng)元的保護機制可能與激活線粒體自噬通路有關(guān)，這與我們前期PD體內(nèi)動物實驗的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果雖然對PD臨床治療具有一定的指導(dǎo)價值，但也有一定不足：首先，目前臨床已有紅景天苷的注射制劑，但臨床目前主要應(yīng)用于冠心病心肌供血不足，以活血化瘀為主要目的。對于紅景天的抗氧化活性、改善神經(jīng)元細胞功能活性的研究目前還處于實驗研究節(jié)段。其次，PD發(fā)病機制復(fù)雜，雖然氧化應(yīng)激反應(yīng)是其主要發(fā)病機制，但是一般藥物的抗氧化活性呈濃度依賴性，因此在保持臨床效果的基礎(chǔ)上如何確定Sal的臨床最適濃度是我們下一步的主要研究方向。