冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的不確定度評(píng)定

河南省開封市疾病預(yù)防控制中心（475000）任泓燕 馮輝

2020年，中國(guó)進(jìn)入了全民小康的時(shí)代，全中國(guó)832個(gè)貧困縣全部脫貧摘帽，這標(biāo)志著中國(guó)人民已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從溫飽到小康的全面過渡。隨著人民物質(zhì)生活的極大滿足，人民對(duì)食品安全的關(guān)注度也極大的提升，特別是今年以來(lái)，新冠疫情肆虐全球，人民對(duì)微生物污染食品，尤其是冷凍食品特別關(guān)注。而菌落總數(shù)的多少一貫是人們用來(lái)判定食品被細(xì)菌污染的程度，它能反應(yīng)出食品在生產(chǎn)、流通，儲(chǔ)存過程中受污染的程度。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品質(zhì)量的好壞。冷凍蝦尾做為一種較易儲(chǔ)存的水產(chǎn)品近年來(lái)尤其受到人民群眾的歡迎，但做為一種冷凍水制品，從最初的生產(chǎn)加工到最后供應(yīng)到人們的餐桌，其流程長(zhǎng)，且對(duì)溫度要求高，因此，更容易受到微生物的污染。

在日常的微生物檢驗(yàn)中，因?yàn)闃悠肥芪廴镜牟课缓统潭炔煌?，受制于取樣等環(huán)節(jié)的影響，所做的結(jié)果常差別較大，因此，檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確與否甚至?xí)绊懫髽I(yè)的效益甚至生存，尤其是微生物測(cè)定不合格，企業(yè)不能提出復(fù)檢。本文通過對(duì)10份市售冷凍蝦尾的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》的規(guī)定，來(lái)對(duì)結(jié)果中不確定度的來(lái)源進(jìn)行分析，并為此建立合適的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，來(lái)評(píng)定冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的不確定度。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣品：隨機(jī)購(gòu)買10個(gè)超市內(nèi)的冷凍蝦尾各一份，500g/份，用無(wú)菌袋包裝，立即放入-18℃的冰箱內(nèi)保存。

耗材：一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿（江蘇華夏瑞泰塑業(yè)有限公司），平板計(jì)數(shù)瓊脂（北京陸橋計(jì)數(shù)股份有限公司）。

1.2 儀器 壓力蒸汽滅菌器（BKQ-B50Ⅱ）（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9075AE）（無(wú)錫瑪瑞科科技有限公司生產(chǎn)）；微生物恒溫培養(yǎng)箱（BJPX-Z1）（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；蘇凈安泰生物安全柜（BSC-1804ⅡB2）（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）。

1.3 方法 按照GB4789.2-2016中規(guī)定的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下：①在無(wú)菌的條件下，稱取樣品25.0g，加入到含有225ml 0.9%的無(wú)菌生理鹽水的勻漿器，均質(zhì)，搖勻。②取新的無(wú)菌吸管做系列10倍濃度稀釋。③取1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000四個(gè)濃度梯度的樣品稀釋液，在每個(gè)樣品稀釋液中取1ml2次，分別加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，另取1ml無(wú)菌生理鹽水加入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，作為空白對(duì)照。④將冷卻至46℃左右的瓊脂培養(yǎng)基分別倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中約15ml～20ml，混勻，待瓊脂凝固后倒置。⑤將所有的培養(yǎng)皿放置于（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)（48±2）h。⑥選擇無(wú)菌培養(yǎng)皿中菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)后乘以稀釋倍數(shù)，得到最終的計(jì)數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不確定度評(píng)價(jià) 對(duì)10個(gè)冷凍蝦尾樣品的菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體數(shù)值見附表。

附表 冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果及相關(guān)計(jì)算

從附表中的具體數(shù)據(jù)可以看出，該10份樣品中所測(cè)得菌落總數(shù)差異較大，因此，必須對(duì)檢測(cè)結(jié)果所得數(shù)值取對(duì)數(shù)后，再進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。按照統(tǒng)計(jì)學(xué)中A類評(píng)定，根據(jù)貝塞爾公式，計(jì)算最后結(jié)果：

在日常菌落總數(shù)的測(cè)定中，按照GB4789.2-2016的規(guī)定，每個(gè)稀釋濃度均會(huì)做2個(gè)平行樣，因此，在標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式中，n=2，代入計(jì)算可得：。

在置信水平P=95%，V=10，通過查閱t分布表可得t95（10）=2.228。

根據(jù)擴(kuò)展不確定度的公式U=KUC，代入計(jì)算可得，U=2.228×0.0253=0.0564。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 根據(jù)2.1中計(jì)算的結(jié)果，筆者以1號(hào)樣品為例，其，其取值區(qū)間應(yīng)為（5.8026±0.0564），計(jì)算可得5.7462～5.8590，取反對(duì)數(shù)后的區(qū)間為（557442～722770）CFU/g，因此，最后的檢測(cè)結(jié)果可估算為（5.6～7.2）×105CFU/g，其他樣品的取值范圍也可以依此類推。

3 討論

在食品微生物檢驗(yàn)中，不確定度來(lái)源很多，比如樣品被污染程度是否均一，取樣是否均一，每一步稀釋的體積誤差有多大，培養(yǎng)箱內(nèi)部的溫度差異有多大，培養(yǎng)的時(shí)間允差，最后計(jì)數(shù)的平行性等因素都是不確定度的來(lái)源。根據(jù)文獻(xiàn)可知，B類不確定度對(duì)食品微生物檢驗(yàn)中的不確定度影響較小[1]。影響食品微生物檢驗(yàn)的不確定主要因素還是人員的重復(fù)性，因此，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)A類不確定度計(jì)算方法貝塞爾公式來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)貝塞爾公式的相關(guān)要求，一般要求對(duì)單一樣品測(cè)定10次以上，但是在日常實(shí)際工作中，幾乎沒有實(shí)驗(yàn)室會(huì)這樣做[2]。因?yàn)樵诰淇倲?shù)的測(cè)定中，樣品檢驗(yàn)都為破壞性檢驗(yàn)，樣品檢驗(yàn)一次后不能再重復(fù)檢驗(yàn)，因此，對(duì)同一樣品做重復(fù)10次以上得到的結(jié)果意義不大。因此，本文通過對(duì)10批次冷凍蝦尾中的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，取對(duì)數(shù)后進(jìn)行相關(guān)計(jì)算。

為了方便建立數(shù)學(xué)模型，要求所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)盡量符合正態(tài)分布，而從培養(yǎng)皿中直接計(jì)數(shù)后乘以稀釋濃度所得到的菌落總數(shù)為偏態(tài)分布[3]。因此，筆者對(duì)這些結(jié)果取對(duì)數(shù)后進(jìn)行分析。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，要想使最后的結(jié)果比較完美，就應(yīng)該嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)步驟，力求重復(fù)性一致。這就要求試驗(yàn)人員要盡量避免實(shí)驗(yàn)中的不確定度，并且盡可能的一個(gè)人完成所有操作，實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)容器和相關(guān)儀器一定要經(jīng)過相關(guān)部門的檢定并嚴(yán)格按照其操作規(guī)范的要求進(jìn)行操作和使用。以最大限度地減少測(cè)定中的不確定度，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

對(duì)于一些檢驗(yàn)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定附近的結(jié)果，要根據(jù)CNAS-CL08《評(píng)價(jià)和報(bào)告測(cè)試結(jié)果與規(guī)定限量的符合性的要求》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行判定。例如，當(dāng)檢驗(yàn)的結(jié)果低于（高于）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的值小于所測(cè)得的不確定度時(shí)，在95%的置信水平下，就不能做出不符合規(guī)定的處理[4]。

通過測(cè)定冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的不確定度評(píng)價(jià)，可以更清楚地反應(yīng)冷凍蝦尾的受污染情況，減少了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和真實(shí)值之間的誤差，更好地為人民群眾的飲食安全保駕護(hù)航。