莼菜多糖的提取及理化性質(zhì)分析

孫海紅 薛魯燕 孫永紅 張瑞巧 王文嬌 蔡葵 趙征宇

摘要 莼菜多糖具有抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生理活性。從莼菜（Brasenia schreberi）中提取膠質(zhì)多糖，采用堿提和酶法預(yù)處理提取莼菜多糖，經(jīng)過除蛋白、醇沉、透析得到多糖組分，并結(jié)合高效液相色譜（HPLC）、原子力顯微鏡（AFM）和掃描電鏡（SEM）等現(xiàn)代儀器技術(shù)和物理化學(xué)方法對其進(jìn)行單糖組分、純度及分子量測定等分析。莼菜多糖的提取工藝為料液比1∶20（W/V），纖維素酶100 U/g、果膠酶100 U/g 、木瓜蛋白酶1 100 U/g，pH為5，預(yù)處理溫度為50 ℃，時間3 h。再用0.02 mol/L NaOH溶液30 ℃加熱3 h提取，得率為0315%。高效液相色譜法測得的莼菜多糖中單糖組成分為鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，摩爾比約為1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0，凝膠滲透色譜測得分子量2.44×106。部分酸水解后單糖組成表明莼菜多糖的中心鏈主要為葡萄糖醛酸和半乳糖，支鏈的邊緣結(jié)構(gòu)或末端殘基結(jié)構(gòu)為鼠李糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖和木糖。通過原子力顯微鏡和掃描電鏡觀察可知莼菜多糖是呈網(wǎng)狀交聯(lián)的凝膠結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞 莼菜;多糖;理化性質(zhì);空間結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S645.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0158-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Extraction and Physicochemical Properties of Polysaccharide from Brassica schreberi

SUN Haihong， XUE Luyan， SUN Yonghong et al

（Qingdao Academy of Agricultural Sciences， Qingdao， Shandong 266100）

Abstract Polysaccharide from Brassica schreberi had antitumor， hypoglycemic， hypolipidemic and other physiological activities. In this paper， the extraction conditions of glycine from Brasenia schreberi were optimized. The physicochemical properties and spatial structure of the glycine were studied. The optimized extraction process was as follows： the ratio of material to liquid 1∶20 （W/V）， cellulase 100 U/g， pectinase 100 U/g， papain 1 100 U/g， pH 5， the pretreatment temperature 50 ℃， time 3 h. And then the product treated with 0.02 mol/L NaOH solution at 30 ℃ for 3 h.The yield of glycine was 0.315%. The monosaccharides was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The glycine was composed of rhamnose， glucuronic acid， galactose， xylose， arabinose and fucose at the ratio of 1.0∶10∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0. It had a molecular weight of 2.44×106. Partial acid hydrolysis revealed that the central chain of polysaccharide was mainly composed of glucuronic acid and galactose. Rhamnose， galactose， fucose， arabinose and xylose consisted the branches of the polysaccharide. Atomic force microscopy and scanning electron microscope showed that B. schreberi polysaccharides formed a chain structure with branch nodes. The chain structure crosslinked to form a network of fibrous structures.

Key words Brasenia schreberi;Polysaccharide;Physicochemical properties;Spatial structure

莼菜（Brasenia schreberi J.F.Gmel）系原始花被亞綱睡蓮科（Nymphaeaceae）植物[1]，屬多年生淡水水生草本植物，又名馬蹄草、湖菜、水葵、露葵，生長于池塘、湖泊和沼澤中[2-3]。近年來，由于其在食用和藥用上的突出價值，因而受到人們的普遍關(guān)注[4]，我國很早就將莼菜作為藥食兩用。作為食物，其鮮嫩滑膩，用來調(diào)羹作湯，清香濃郁，被視為宴席上的珍貴食品。據(jù)《本草綱目》記載[5]，莼菜具有消渴熱痹、治熱疸、厚腸胃、安下焦、逐水、解百藥毒等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗感染、降血糖、降血脂、延年益壽的功效[6-9]。目前，國內(nèi)對莼菜多糖的研究主要集中在對莼菜的深加工研究和莼菜多糖的提取工藝優(yōu)化方面，這為研制具有營養(yǎng)保健作用的莼菜多糖飲料奠定了基礎(chǔ)。但是，由于莼菜多糖黏度大，難以純化，國內(nèi)現(xiàn)有的大部分研究都停留在多糖粗提物的提取和生理功能方面，而對莼菜多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析非常少，沒有給莼菜體外膠質(zhì)活性多糖的分離純化及其生理生化功能的研究打下好的基礎(chǔ)。多糖分離純化手段的進(jìn)步和現(xiàn)代儀器測試技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是原子力顯微鏡（AFM）和核磁共振（NMR）技術(shù)在多糖領(lǐng)域的應(yīng)用，促進(jìn)了多糖結(jié)構(gòu)的深入研究。在莼

菜多糖活性和提取工藝研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代色譜分離技術(shù)對莼菜膠質(zhì)多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、主鏈和支鏈具體連接方式以及構(gòu)型和空間結(jié)構(gòu)等問題進(jìn)行研究，對莼菜多糖的后續(xù)開發(fā)意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

莼菜購自浙江杭州;甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（GaD）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）標(biāo)準(zhǔn)品及胎牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為美國Sigma公司產(chǎn)品;高聚葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品（P82）以及Shodex Ohpak SB-804HQ（8.0 mm×300 mm）凝膠色譜柱為日本Shodex公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。高效液相色譜儀（LC-20AD，日本島津公司）、紫外檢測器（SPD-20A Shimadzu公司）、紫外可見分光光度計。

1.2 莼菜多糖的提取[10-11]

采用酶預(yù)處理結(jié)合堿液提取：取醋酸浸漬過的莼菜，按料液比1∶20（W/V）加入蒸餾水，加入纖維素酶100 U/g、果膠酶100 U/g、木瓜蛋白酶1 100 U/g，調(diào)節(jié)pH為5，預(yù)處理溫度為50 ℃，浸漬3 h后滅酶。再用0.02 mol/L NaOH溶液提取莼菜多糖，置于熱電恒溫水浴鍋中，30 ℃加熱3 h，殘渣按上述提取方法再重新提取1次，趁熱離心（4 000 r/min，15 min），合并2次提取的上清液，調(diào)節(jié)pH至中性，濃縮提取液至原體積的1/10。

在提取莼菜多糖過程中，同時會提取出大量蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、小分子有機(jī)物（氨基酸和低聚物等）以及色素等。采用Sevage法脫蛋白：1/3氯仿-正丁醇（體積比為4∶1），與濃縮后的多糖提取液混合，在常溫下經(jīng)磁力攪拌30 min，離心，使蛋白質(zhì)變性再除去有機(jī)相，變性后的蛋白質(zhì)呈膠狀，重復(fù)上述操作，直至無游離蛋白為止。

將脫完蛋白的莼菜多糖樣品用4倍體積的預(yù)冷95%乙醇溶液沉淀，攪拌均勻，放入4 ℃冰箱中靜置過夜。

乙醇沉淀莼菜多糖，離心（4 000 r/min，15 min），棄上清液，取沉淀溶解，放入透析袋中（截留分子量3 500透析袋）透析48 h，透析過程中每隔4 h換一次水。取透析后的莼菜提取液濃縮（原體積的1/20～1/10，45 ℃），冷凍干燥得到莼菜多糖樣品，粗品為黃褐色絮狀物。

粗多糖得率=粗多糖的質(zhì)量/新鮮莼菜的質(zhì)量×100%

1.3 莼菜多糖的單糖組成分析[12]

多糖的完全酸水解：準(zhǔn)確稱取10 mg莼菜多糖樣品，在安瓿瓶中加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸（TFA），封管后再置于110 ℃烘箱內(nèi)進(jìn)行水解反應(yīng)8 h。多次反復(fù)加入甲醇蒸干除去溶液中的三氟乙酸，烘干。單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：準(zhǔn)確稱取等量干燥的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，加入蒸餾水配制成1.0 mg/mL溶液。

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法對莼菜多糖完全水解后的產(chǎn)物和單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生和高效液相色譜分析。色譜條件：色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH =6.7），乙腈（CH3CN 82∶18，V/V），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL;檢測器：UV 254 nm。

1.4 莼菜多糖的部分酸水解[13]

取多糖樣品10 mg于安瓿瓶中，加入4 mL 0.01 mol/L的TFA，密封后105 ℃水解1 h，水解樣品除去TFA并濃縮后加4倍體積無水乙醇沉淀多糖，于4 ℃冰箱靜置、離心，上清1濃縮、烘干;所得沉淀部分烘干后，加入4 mL 0.05 mol/L的TFA，105 ℃水解1 h，水解樣品加4倍體積乙醇沉淀多糖，靜置、離心，上清2濃縮、烘干;所得沉淀烘干，繼續(xù)加入4 mL 0.1 mol/L的TFA，105 ℃水解1 h，水解樣品加4倍體積乙醇沉淀多糖，靜置、離心，上清3濃縮、烘干，沉淀烘干。

1.5 莼菜多糖的分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜法[14]測定莼菜多糖分子量，此方法測定分子量的范圍很寬。用流動相將莼菜多糖配制成6 mg/mL的溶液，離心并吸取上清液，置于4 ℃冰箱備用。試驗條件：凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm），柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，流動相為01 mol/L的Na2SO4溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將已知分子量的系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖用01 mol/L的Na2SO4 溶解，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為5 mg/mL。用保留時間（tR）作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對數(shù)（logMw）作為縱坐標(biāo)，利用GPC分析軟件作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 莼菜多糖的空間結(jié)構(gòu)觀察[15]

原子力顯微鏡觀察：用去離子水配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的樣品溶液并冷卻至室溫，取適量樣品滴于新鮮剝離的云母片表面，在干燥器中室溫干燥過夜，取準(zhǔn)備好的云母片進(jìn)行原子力顯微鏡（橫向分辨率為0.1 nm，垂直分辨率為0.01 nm）觀察。

掃描電鏡：最大放大倍數(shù)100 萬倍，分辨率0.14 nm，加速電壓120 kV。先將配制好的 樣品溶液進(jìn)行超聲分散（超聲5 min），然后將其滴于有支撐膜的銅網(wǎng)上，常溫下放至干燥后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 莼菜多糖的提取

莼菜膠質(zhì)多糖屬于黏液細(xì)胞分泌的酸性雜多糖，采用醋泡的方法可以減少其在水中的溶出，維持其凝膠狀態(tài)。纖維素酶、果膠酶及蛋白酶處理，可以破壞莼菜細(xì)胞細(xì)胞壁，促進(jìn)莼菜膠質(zhì)多糖的溶出，并減少蛋白及果膠類雜質(zhì)，提高多糖的純度。通過堿提可以使酸性多糖離子化，增加提取率。堿類溶劑提取莼菜多糖的效果比普通的熱水提取效果好，但是高濃度的堿溶液會使蛋白質(zhì)、果膠和可溶性色素等物質(zhì)大量溶出[10]，最佳濃度為0015 mol/L，堿浸提取溫度過高會使所得的莼菜多糖顏色加深，故30 ℃為最佳提取溫度。酶提加堿提可以最大限度促進(jìn)莼菜膠質(zhì)多糖的釋放。提取液濃縮為原體積的1/20，脫蛋白后4倍體積乙醇沉淀，透析后凍干，濕重得率約為035%。

2.2 莼菜多糖的單糖組成

PMP柱前衍生單糖組成分析表明（圖1、2），莼菜多糖中單糖組成主要有半乳糖，另外還有少量的鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖按照其相對峰面積比可得單糖組分的摩爾比約為1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。從糖組成比例來看，莼菜多糖以半乳糖組成比例最高。結(jié)果與之前報道的莼菜多糖的大致相同，但是單糖的組成比例略有不同。由于莼菜的營養(yǎng)物質(zhì)受到生長環(huán)境和采摘期時間的影響，各文獻(xiàn)報道的組分比也各不相同[16]。

2.3 莼菜多糖的部分酸水解

部分酸水解的原理是利用多糖鏈中支鏈糖苷鍵易水解脫落，而構(gòu)成糖鏈的中心鏈結(jié)構(gòu)部分相對穩(wěn)定，因此了解多糖結(jié)構(gòu)、單糖組成分布常采用部分酸水解法處理。多糖經(jīng)過部分酸水解后醇沉、離心，將上清液和沉淀分別進(jìn)行測量可以得到許多組分片段，從這些小片段的單糖組成可以推測多糖鏈的單糖分布。由結(jié)果可知，在弱酸的條件下，首先被降解下來的是鼠李糖、半乳糖、木糖、巖藻糖和阿拉伯糖。特別是鼠李糖、巖藻糖和阿拉伯糖在上清1中含量最高，說明這3種糖最容易被降解下來，并位于莼菜多糖的外圍支鏈中。在上清2中，木糖增多，鼠李糖、巖藻糖和阿拉伯糖減少，說明木糖位于支鏈內(nèi)側(cè)或者靠近主鏈的位置。4個組分中半乳糖一直存在，表明半乳糖既存在于支鏈，又存在于主鏈。葡萄糖醛酸只在上清3和沉淀中存在，表明葡萄糖醛酸很有可能存在于主鏈中。

2.4 莼菜多糖的分子量

對莼菜多糖進(jìn)行凝膠滲透色譜分析，圖中樣品峰呈單一對稱峰，表明莼菜多糖純度較高，為單一組分，但是樣品峰跨度較大，可能是由于樣品黏度較大。根據(jù)已知分子量標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算后得莼菜多糖分子量為2.44×106。由此可知，莼菜多糖屬于天然的高分子量多糖。

通過部分酸水解結(jié)果可知，莼菜多糖的主鏈主要由葡萄糖醛酸和半乳糖組成，支鏈主要由鼠李糖、半乳糖、木糖、巖藻糖和阿拉伯糖組成，鼠李糖、巖藻糖和阿拉伯糖位于支鏈的最外側(cè)[17]（表1）。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2021年

2.5 莼菜多糖的空間結(jié)構(gòu)

圖3為莼菜多糖水溶液的原子力顯微鏡掃描圖，可見莼菜多糖在云母片上呈環(huán)形網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，且是由大分子鏈相互連接而成。每個環(huán)狀結(jié)構(gòu)上可以清楚地看到側(cè)支鏈結(jié)構(gòu)，一般情況下多糖的分子鏈大小為0.1～1.0 nm，該多糖聚合物分子間互相纏繞，鏈之間通過不同糖單元連接成大大小小的環(huán)或者分支側(cè)鏈，證明了多糖大分子是具有高度分支的化學(xué)結(jié)構(gòu)。掃描電鏡也顯示莼菜多糖具有疏松多孔的交聯(lián)結(jié)構(gòu)（圖4）。由此可見，莼菜多糖在水溶液中可以形成疏松多孔的凝膠狀結(jié)構(gòu)[18]。

3 結(jié)論

通過酶提聯(lián)合堿提的方法確定莼菜多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20（W/V），纖維素酶100 U/g、果膠酶100 U/g、木瓜蛋白酶1 100 U/g，pH為5，預(yù)處理溫度為50 ℃，時間3 h。再用0.015 mol/L NaOH溶液30 ℃加熱3 h提取，得率為0.315%，純化分離可得分子量大小為2.44×106。高效液相色譜法測得的莼菜多糖中單糖組成分為鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，按照其相對峰面積比可得單糖組分的摩爾比約為1.0∶1.0∶6.8∶2.0∶0.3∶3.0。該糖的中心鏈主要為葡萄糖醛酸和半乳糖，支鏈的邊緣結(jié)構(gòu)或末端殘基結(jié)構(gòu)為鼠李糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖，木糖則靠近主鏈的位置。原子力顯微鏡和掃描電鏡可觀察到莼菜多糖分子以聚合體狀態(tài)呈環(huán)形網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)并形成凝膠，所以莼菜多糖作為富含半乳糖的酸性雜多糖具有獨特的理化性質(zhì)和凝膠特性。該研究為莼菜多糖進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了重要參考價值。

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