豫西煙區(qū)煙草病毒病病原檢測及復(fù)合侵染分析

李靜靜 薛立新 張勝 白靜科 金磊 尤芳芳 許儀

摘要 為明確豫西煙區(qū)煙草病毒病的主要病毒種類，利用9種病毒血清通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對2019年豫西（三門峽、洛陽、濟源）3個煙葉產(chǎn)區(qū)的102份病毒病樣品進行了系統(tǒng)檢測。結(jié)果表明，豫西煙區(qū)病毒總檢出率為94.12%;病毒種類主要有5種，分別為煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）、煙草黃瓜花葉病毒（tobacco cucumber mosaic virus，CMV）及煙草馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY），TMV和TVBMV為優(yōu)勢種，其中三門峽優(yōu)勢種為TVBMV，洛陽優(yōu)勢種為TMV，濟源優(yōu)勢種為TMV。豫西煙區(qū)病毒侵染類型中單一侵染率為35.42%，TMV的單一侵染率最高，為18.75%;2種及以上病毒復(fù)合侵染率為64.58%，其中TVBMV+TEV的復(fù)合侵染率最高，為11.46%，其次是TMV+CMV+TVBMV+TEV，復(fù)合侵染率為10.42%。

關(guān)鍵詞 煙草;病毒;病原檢測;復(fù)合侵染

中圖分類號 S435.72文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0132-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.036

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Pathogen Detection and Multiple Infection Analysis of Tobacco Virus Disease in Tobacco Growing Areas of Western Henan Province

LI Jingjing1，XUE Lixin1，ZHANG Sheng2 et al （1.Jiyuan Branch of Henan Tobacco Company，Jiyuan，Henan459000;2.Xiangxi Autonomous Prefecture of Hunan Tobacco Company，Jishou，Hunan 416000）

Abstract In order to identify the main types of tobacco virus diseases in tobacco growing areas of Western Henan Province （Sanmenxia， Luoyang and Jiyuan）， 102 samples of tobacco virus diseases from three tobacco producing areas in Western Henan Province in 2019 were detected by enzymelinked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that the total detection rate of virus was 94.12%， and there were five kinds of virus， including tobacco mosaic virus （TMV）， tobacco vein banding mosaic virus （TVBMV），tobacco etch virus （TEV）， tobacco cucumber mosaic virus （CMV） and tobacco potato virus Y （PVY），TMV and TVBMV were the dominant species.Among them， TVBMV was the dominant species in Sanmenxia， TMV in Luoyang and TMV in Jiyuan.The single infection rate was 35.42%，the single infection rate of TMV was the highest， 18.75%;the compound infection rate of two or more viruses was 64.58%， in which TVBMV + TEV was the highest （11.46%），followed by TMV + CMV + TVBMV + TEV，the compound infection rate was 10.42%.

Key words Tobacco;Virus;Pathogen detection;Compound infection

病毒病是全世界煙草栽培地區(qū)普遍發(fā)生的一類病害，也是我國各煙區(qū)的重要病害，近年來有日益嚴(yán)重的趨勢[1]。病毒病可造成花葉、畸形、壞死、矮化等癥狀，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。據(jù)2011—2015年統(tǒng)計，常見病毒病害如煙草普通花葉病毒病、煙草黃瓜花葉病毒病、煙草馬鈴薯Y病毒病所造成的煙草經(jīng)濟損失

占煙草病蟲害所造成總損失的43%左右，超過真菌病害所造成的損失，成為對煙草生產(chǎn)威脅最大的一類病害[2]。目前，在我國已報道的煙草病毒病病害有25種，約占煙草侵染性病害種類的1/4[2-3]，其中嚴(yán)重影響煙草生長的病毒種類主要有6種：煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、煙草黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、煙草馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、煙草馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）和煙草脈帶花葉病毒（tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）[4-6]。這6種病毒在我國煙草病毒中所占比例最大，造成危害和損失也最嚴(yán)重[4，7]。

李淑君等[8]曾提出2000年河南省許昌煙區(qū)病毒病主要有PVY、CMV、TMV和煙草環(huán)斑病毒病等;李義強等[9-10]研究表明，PVY、CMV是危害河南煙區(qū)的主要病害種類，且TRSV已逐漸成為又一重要病毒;羅朝鵬等[11]于2012年發(fā)現(xiàn)河南煙區(qū)主要病毒病已由PVY和CMV轉(zhuǎn)變?yōu)镃MV和TMV;張全民等[12]發(fā)現(xiàn)類似研究結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)TEV的發(fā)生率較往年有所提高，白靜科等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV為河南煙區(qū)危害嚴(yán)重的5種病毒，TMV已取代CMV發(fā)展為優(yōu)勢種。雖然前人對河南煙草病毒病進行了較多研究，但針對當(dāng)前豫西煙區(qū)病毒病種類鑒定報道較少，吉貴鋒等[14]只報道了豫西煙區(qū)2011—2013年病毒病整體發(fā)生規(guī)律，并未對病毒病種類及地區(qū)分布進行區(qū)分。近年來，豫西煙區(qū)煙草種植面積保持穩(wěn)定，占全省煙葉種植面積的40%左右，因此，做好豫西煙區(qū)病毒病防治意義重大。為明確當(dāng)前豫西煙區(qū)煙草病毒種類和變化趨勢，筆者于2019年煙葉生產(chǎn)季節(jié)分別從豫西不同煙葉產(chǎn)區(qū)取樣，并利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行檢測，旨在為豫西煙區(qū)煙草病毒病的病原種類及病毒病的有效防治研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集。

2019年6—8月，在豫西煙區(qū)三門峽（盧氏、靈寶）、洛陽（汝陽、伊川）、濟源（王屋、邵原）3個煙葉產(chǎn)區(qū)采集102個典型病毒病癥狀的煙葉樣品。部分樣品呈現(xiàn)葉色濃淡不均的“花葉”，或葉面隆起形成“泡斑”，或葉緣上卷葉基變長，或脈壞死、莖壞死，部分樣品出現(xiàn)褐色閃電狀壞死紋或脈帶等癥狀，樣品于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑和儀器。

TMV、CMV、PVY、TEV、PVX、番茄斑萎病毒（TSWV）、煙草條紋病毒（TSV）血清試劑盒購自美國Agdia公司，煙草壞死病毒（TNV）、TVBMV血清試劑盒購自德國DSMZ公司。

組織研磨儀（Bio-DL easy extract P型，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）;洗板機（Thermo MK2賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;酶標(biāo)儀（Tecan infinite F50，瑞士帝肯公司）。

1.2 檢測方法

參照試劑盒說明書利用雙抗體夾心ELISA法（DAS-ELISA）檢測所取煙草病毒病樣品。以同時購置的陽性質(zhì)控物和陰性質(zhì)控物為對照，每個樣品檢測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草病毒病種類

ELISA檢測結(jié)果（表1）表明，102份煙草病毒病樣品中，共有96份樣品與6種供試血清中的1種或多種血清發(fā)生不同程度的陽性反應(yīng)，表明所采集煙葉樣品中存在TMV、CMV、TVBMV、TEV、PVY、TNV中的1種或多種病毒。在已檢測出的6種病毒中，以TMV和TVBMV的侵染率最高，二者總檢出率均為54.90%，其他依次為TEV（41.18%）、CMV（33.33%）、PVY（13.73%）、TNV（3.92%）。6種病毒在不同煙區(qū)的分布存在差異，在三門峽煙草樣品中的檢出率表現(xiàn)為TVBMV>TEV>CMV>TMV>PVY，TNV檢出率為0;在洛陽煙草樣品中的檢出率表現(xiàn)為TMV>TVBMV>TEV=TNV，CMV、PVY檢出率為0;在濟源煙草樣品中的檢出率分別為87.50%、0、18.75%、12.50%、31.25%和6.25%，表現(xiàn)為TMV>PVY>TVBMV>TEV>TNV，CMV的檢出率為0。另外，共6份煙草樣品未檢測到上述6種病毒。

可見，豫西煙區(qū)病毒病種類主要為TMV、TVBMV、TEV、CMV及PVY，TMV和TVBMV為優(yōu)勢種，其中三門峽優(yōu)勢種為TVBMV，洛陽優(yōu)勢種為TMV，濟源優(yōu)勢種為TMV。

2.2 煙草病毒侵染的類型

對96份陽性樣品進行病毒侵染類型分析，結(jié)果有34份樣品為單一病毒侵染，總檢出率為35.42%（圖1）;其余62份樣品均為2種以上病毒復(fù)合侵染，其中2種病毒復(fù)合侵染的檢出率為32.29%，3種、4種和5種病毒復(fù)合侵染的檢出率分別為20.83%、10.42%、和1.04%（表2）。

2.2.1 單一病毒侵染。

在單一病毒侵染樣品中，僅發(fā)現(xiàn)TMV、TVBMV、CMV及PVY的單獨侵染，其檢出率分別為18.75%、8.33%、6.25%和2.08%。不同煙區(qū)煙草樣品中受單一病毒侵染的情況不同，三門峽煙草樣品受TVBMV、CMV及PVY這3種病毒的單一侵染，洛陽煙草樣品受TMV、TVBMV這2種病毒的單一侵染，濟源煙草樣品僅受TMV這1種病毒的單一侵染。

2.2.2 病毒復(fù)合侵染。

ELISA檢查結(jié)果（表2）表明，在96份陽性樣品中，62份煙草樣品檢測到2種以上病毒的復(fù)合侵染，總檢出率為64.58%，共有15種病毒侵染類型。2種病毒復(fù)合侵染類型中，TVBMV+TEV的復(fù)合侵染率最高，為11.46%;其次是TMV+TVBMV，為8.33%。3個煙區(qū)中，三門

峽和濟源TVBMV+TEV的復(fù)合侵染率也最高，洛陽僅檢測到TMV+TVBMV的復(fù)合侵染，其侵染率為20%;三門峽檢測到的2種病毒復(fù)合侵染類型最多，在病毒病防治中應(yīng)加以重視。

豫西煙區(qū)3種病毒病復(fù)合侵染呈現(xiàn)6種不同類型，其中，三門峽3種、濟源2種、洛陽1種。6種類型中，CMV+TVBMV+TEV的復(fù)合侵染率在豫西及三門峽均最高，分別為6.25%、10.34%;濟源煙區(qū)中，CMV+TEV+PVY的復(fù)合侵染率最高，高達22.22%，應(yīng)加以重點關(guān)注，做好防范。

4種及5種病毒病復(fù)合侵染的情況均只有1種，且均出現(xiàn)在三門峽;在三門峽煙區(qū)中，靈寶、盧氏均檢測到TMV+CMV+TVBMV+TEV的復(fù)合侵染類型，侵染率達17.24%;靈寶檢測到TMV+CMV+TVBMV+TEV+PVY復(fù)合侵染類型，侵染率為1.72%。

3 結(jié)論與討論

煙草病毒病種類不斷發(fā)生變化。2009—2012年，全國煙草病毒病的種類由普遍侵染的PVY轉(zhuǎn)變?yōu)門MV和CMV[11，15];2014—2016年，湖南煙區(qū)PVY發(fā)病率逐年提高，年度間變化較大[16];2015—2017年，河南煙區(qū)病毒病優(yōu)勢種已由CMV轉(zhuǎn)變?yōu)門MV，主要病害種類發(fā)生了變化，PVY的檢出率有所下降，TVBMV危害逐漸加重[13]。河南煙區(qū)優(yōu)勢毒原的變化給煙草病毒病的防治工作帶來了巨大困難，值得高度重視。該研究中，豫西煙區(qū)主要病毒病種類TMV、TVBMV、TEV、CMV及PVY，其中TMV和TVBMV為優(yōu)勢種，與前人研究結(jié)果一致。

羅朝鵬等[11]研究表明，全國13個煙區(qū)2010和2011年煙草病毒病復(fù)合侵染率分別為34.9%和28.6%，且存在7種復(fù)合侵染類型。李金嶺等[4]研究發(fā)現(xiàn)陜西煙區(qū)田間煙草復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，2種以上病毒的復(fù)合侵染總檢出率為82.05%，共檢測出9種復(fù)合侵染類型。白靜科等[13]研究表明，河南煙區(qū)2種及以上病毒復(fù)合侵染率為61.84%，復(fù)合侵染類型多達30余種。該研究發(fā)現(xiàn)，豫西煙區(qū)田間煙草病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重，2種及以上病毒復(fù)合侵染率為64.58%，三門峽煙區(qū)的復(fù)合侵染現(xiàn)象相對較為嚴(yán)重，且存在4種及以上病毒復(fù)合侵染情況，這與白靜科等[13]研究結(jié)果不一致，推測主要有兩方面的原因：一是取樣環(huán)境不同，檢測出病害種類不同;二是由于氣候條件、品種、耕作制度等多種因素的影響，病毒復(fù)合侵染的情況變得更加復(fù)雜。

佟愛仔等[17]研究表明，TEV侵染煙草在田間的癥狀不盡相同，且復(fù)雜多樣，可能與不同病毒種類復(fù)合侵染有關(guān)，種植品種、地理位置和氣候條件也會引起不同的癥狀表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，在同一葉片中，不同取樣位置檢查到的病毒種類也不同，這可能與病毒侵染葉片時間及取樣時間不同有關(guān)，說明病毒侵染的復(fù)雜性;也可能是取樣點過少造成結(jié)果誤差。此外，在此次檢測的煙草樣品中，有6個煙草樣品中未檢測到TMV、CMV、TVBMV、TEV、PVY及TNV 6種病毒，但煙草樣品表現(xiàn)出明顯的病毒病癥狀，說明這些樣品中可能含有未檢測到的病毒種類[18]，田間煙草感病樣品癥狀的復(fù)雜性可能與此有關(guān)。

豫西煙區(qū)病毒病總檢出率為94.12%;豫西煙區(qū)病毒病種類主要為TMV、TVBMV、TEV、CMV及PVY，其中TMV和TVBMV為優(yōu)勢種。侵染類型中單一侵染率為35.42%，TMV的單一侵染率最高，為18.75%;2種及以上病毒復(fù)合侵染率為64.58%，其中TVBMV+TEV的復(fù)合侵染率最高，為11.46%，其次是TMV+CMV+TVBMV+TEV，復(fù)合侵染率為10.42%。豫西3個煙區(qū)的主要病害種類及侵染類型均存在差異，在實際病害防治中要結(jié)合實際、綜合防治。

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